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                  案例分享

                  Nature丨代謝流分析揭示線粒體缺陷的腫瘤細胞通過還原羧化支持生長

                  發布日期:2021.04.25

                  導讀


                  胸膜積液(PEs)由多種全身性炎性、感染性和惡性疾病引起。當有胸腔積液時,應尋找積液產生的原因,確保適當的治療。根據積液形成的機制,胸腔積液可分為漏出液和滲出液。如果病人,胸腔積液為漏出液,則可以進行全身治療,無需將注意力轉移到胸膜。如果存在滲出性積液,則應檢查胸膜以找出局部問題的原因。中國超過833名未確診的胸腔積液患者成功的接受了醫學胸腔鏡檢查,在接受內科胸腔鏡檢查的患者中,有40%的患者確診為結核性胸腔積液,遠高于許多國家,并且在中國最常見未確診的胸腔積液是惡性或結核性胸腔積液。本篇文獻展示了一種區分結核性胸腔積液(TBPEs)和惡性胸腔積液(MPEs)的方法。線粒體代謝為腫瘤細胞的生長和增殖提供了合成大分子物質的前體,在正常腫瘤細胞線粒體中,葡萄糖和谷氨酰胺的氧化代謝會產生檸檬酸和乙酰輔酶A來提供腫瘤發生所必需的脂質合成。然而有些腫瘤細胞在檸檬酸循環(citric acid cycle,CAC)或電子傳遞鏈(electron transport chain,ETC)中存在基因突變,從而使線粒體正常的氧化功能喪失,此時腫瘤細胞如何產生大分子合成的前提尚不清楚。代謝流分析可以定量化表征細胞代謝的動態變化和代謝途徑的流量精細分布,揭示疾病發生發展過程中的主要代謝通路變化,促進對生理或病理機制的認識(譜領生物可提供)。本研究通過代謝流分析發現線粒體缺陷的腫瘤細胞是通過谷氨酰胺還原羧化而非氧化代謝來作為形成檸檬酸的主要途徑。該途徑利用依賴于NADP+/NADPH的異檸檬酸脫氫酶和谷氨酰胺產生的檸檬酸,產生用于脂質合成的乙酰輔酶A(AcCoA)并產生CAC代謝物和相關生物大分子合成所需的代謝中間體。研究結果揭示了一種新的谷氨酰胺依賴的代謝途徑,逆轉了典型CAC的許多反應來支持腫瘤細胞生長,并解釋了腫瘤細胞在線粒體代謝受損的情況下如何產生CAC代謝中間體以支持腫瘤細胞的生長。


                  應用案例
                  線粒體缺陷的腫瘤細胞通過還原羧化支持生長


                  圖片關鍵詞


                  01 
                  實驗材料
                  143B人骨肉瘤細胞:

                  WT 143B:wild-type 143B

                  CYTB 143B:cytochrome b-mutant 143B

                  腎癌細胞:

                  UOK 262 cell

                  小鼠胚胎成纖維細胞:

                  MEF:mouse embryonic fibroblasts


                  02 
                  實驗流程

                  實驗選取兩種線粒體功能不同但增殖相似的細胞(WT 143B、CYTB 143B)作為研究對象。

                  1.比較CYTB 143B細胞與WT143B細胞的代謝差異

                  D[U-13C]glucose(全標葡萄糖)培養細胞并檢測CAC中間代謝產物。結果顯示WT 143B細胞中13C檸檬酸含量豐富,其中占比最多的為Citrate m+2(檸檬酸中有2個C為13C),這是由未被標記的草酰乙酸(OAA)與來自于D[U-13C]glucose的[1,2-13C]acetyl-coA結合產生的。Citrate m+2經過一次CAC后則變為Citrate m+4。而在CYTB 143B細胞中大多數檸檬酸等代謝物不含有13C(m+0),表明PDH對乙酰輔酶A的貢獻受到抑制(Figure 1)。


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                  Figure 1


                  2.比較兩種細胞中谷氨酰胺的代謝

                  腫瘤細胞使用谷氨酰胺間接補充CAC代謝中間體以補充生物合成所需要的前體。用L[U-13C]glutamine培養兩種細胞,并通過檢測CAC中間代謝物來研究細胞對谷氨酰胺的代謝方式。樣本中檢測到大量的m+4延胡索酸、蘋果酸和檸檬酸表明WT 143B細胞中谷氨酰胺主要以氧化的方式代謝谷氨酰胺。相反,CYTB 143B細胞中僅有少量citrate m+4但有大量citrate m+5,fumarate m+3、malate m+3表明其主要通過α-KG還原羧化產生檸檬酸并進一步產生乙酰輔酶A和草酰乙酸(Figure 2)。

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                  Figure 2


                  3.確定參與還原羧化的酶

                  在L[U-13C]glutamine培養的CYTB 143B細胞中通過分別抑制CYTB 143B細胞IDH1(isocitrate dehydrogenase 1)、IDH2、IDH3并檢測citrate的標記情況來確定在細胞利用谷氨酰胺進行還原羧化中發揮作用的酶。結果顯示谷氨酰胺轉化為谷氨酸不受影響的情況下,抑制IDH1和IDH2會使citrate m+5減少,而抑制IDH3則不會產生顯著影響。由于IDH1和IDH2主要存在于細胞質和線粒體,所以CYTB 143B細胞的還原羧化可能發生于這兩個地方(Figure 3)。


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                  Figure 3


                  4.確定還原羧化是否有助于癌細胞生長所需要的脂質合成

                  首先通過3H2O確定兩種細胞均會產生新的脂肪酸。然后用14C glucose和14Cglutamine分別培養WT 143B細胞和CYTB 143B細胞。結果顯示CYTB 143B細胞中幾乎不含有放射性葡萄糖而含有大量放射性谷氨酰胺,說明用于脂肪合成的營養物質發生了很大變化。隨后,兩種細胞均培養于13C標記葡萄糖和未標記谷氨酰胺或未標記葡萄糖和標記谷氨酰胺中,并用核磁分析脂質標記情況。結果顯示,WT 143B細胞中葡萄糖作為最主要營養物質,谷氨酰胺作為次要營養物質用于脂質合成,而在CYTB 143B細胞中則相反(Figure 4)。

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                  Figure 4

                  5.確定其他類似于CYTB 143B的腫瘤細胞是否也存在谷氨酰胺依賴的還原羧化

                  實驗選取腎癌細胞UOK262細胞作為驗證對象,其呼吸存在缺陷,FH(fumarate hydratase)缺乏活性。該細胞在glutamine缺乏時無法增殖,因其缺乏FH活性導致細胞無法進行完整谷氨酰胺氧化反應。D[U-13C]glucose培養實驗顯示該細胞代謝情況與CYTB 143B細胞相似,僅有少量citrate m+2存在。L[U-13C]glutamine實驗顯示存在大量malate m+3和fumarate m+4。表明在FH缺乏活性的時候,UOK262細胞通過氧化和還原兩種代謝方式來產生檸檬酸和乙酰輔酶A用于脂質合成并產生四碳CAC中間體(Figure 5)。


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                  Figure 5


                  6.確定谷氨酸依賴的還原羧化是否線粒體永久代謝異常細胞特有

                  在蛋白合成抑制劑cycloheximide預處理后一小時后,使用antimycinrotenone急性抑制小鼠成纖維細胞的ETC會使得細胞對谷氨酰胺的代謝明顯由氧化形式轉變為還原,且不消失。Metformin也可通過抑制呼吸誘導谷氨酰胺依賴的還原羧化。結果表明谷氨酰胺依賴的還原羧化是一種常見的細胞對線粒體代謝受損的反應Figure 6。


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                  Figure 6

                  03 
                  小結

                  已有研究顯示谷氨酰胺還原羧化是哺乳動物細胞中檸檬酸/異檸檬酸和脂質的次要碳來源。但本次分享的研究發現這一途徑也可作為主要的代謝方式產生脂質促進癌細胞的生長,并在抑制ETC時被強烈誘導。這可能是由于ETC功能受限、NAD+/NADH比值下降、CAC氧化能力降低導致的氧化還原代謝紊亂。這種重新定向的CAC擴展了谷氨酰胺代謝在癌細胞生長中的多功能性。


                  ? 文獻出處

                  Mullen A R , Wheaton W W , Jin E S , et al. Reductive carboxylation supports growth in tumour cells with defective mitochondria. Nature, 2012, 481(7381):385-8.


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