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                  案例分享

                  Mol. Neurodegener.丨UHPLC-MS+代謝組學技術全面分析帕金森病的代謝特征

                  發布日期:2021.03.23

                  導讀


                  帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一種常見的神經系統變性疾病,患者以老年人多見,平均發病年齡為60歲左右,40歲以下起病的青年帕金森病較少見。據統計,,我國60歲以上人群PD的患病率大約是1.0%。而且大部分帕金森病患者為散發病例,僅有不到10%的患者有家族史。帕金森病最主要的病理改變是中腦黑質多巴胺(dopamine, DA)能神經元的變性死亡,表現為自主運動的易化性降低,由此而引起紋狀體DA含量顯著性減少而致病。導致這一病理改變的確切病因目前仍不清楚,遺傳因素、環境因素、年齡老化、氧化應激等均可能參與PD多巴胺能神經元的變性死亡過程。

                  就目前而言,PD的診斷主要依賴于臨床癥狀的評估,雖然神經成像技術已經很明顯的改善了PD的診斷和分期,但是檢測費用特別昂貴。因此,許多科研工作者致力于尋找有助于PD診斷的生物標志物,以開辟一條全新的診斷途徑。

                  2021年1月,來自大連醫科大學第一附屬醫院的樂衛東教授及其團隊在Molecular Neurodegeneration在線發表了Comprehensive metabolic profiling of Parkinson’s disease by liquid chromatography-mass spectrometry的研究論文,在這項研究中作者利用基于LC-MS的非靶向代謝組學方法來研究3個特征明確的隊列中與PD相關的代謝變化,對PD患者的重要代謝紊亂進行綜合評價,提高了對PD發病機制的認識,并有助于篩選治療干預的靶點。本研究確定的生物標志物可能為帕金森病的臨床診斷提供新的方法。


                  應用案例
                  UHPLC-MS代謝組學技術全面分析
                  帕金森病的代謝特征


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                  材料與方法

                   本次研究共采集血漿460例,共計分為三組,其中PD患者223例,健康對照組(HC)169例,與PD無關的神經系統疾病患者(NDC)68例。

                  在Chort 1中,所有帕金森病患者都是藥物缺乏癥。
                  在Chort2中,包括97例患者,其中51例接受治療,14例未接受藥物治療,32例為HC。
                  在Chort3中,除了PD和HC外,(NDC)組包括27例腦血管疾病、9例癲癇、9例周圍性眩暈、8例周圍神經病變、8例焦慮/睡眠障礙、5例暈厥和2例重癥肌無力。除癲癇患者常規接受抗癲癇藥物治療外,大多數NDC患者沒有接受常規藥物治療。參與者的詳細情況描述見表1。


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                  表1 研究人群的特征


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                  研究結果

                  1、三個隊列差異代謝物鑒定

                  研究人員采用超高效液相色譜(UPLC,Waters,Manchester,UK)上結合tripleTOF正負離子模式系統進行代謝譜分析,經過對三個隊列樣本進行檢測和分析,最終三個隊列分別檢測和鑒定出226、202和204個代謝產物,如圖2所示:



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                  圖2  三個隊列檢測的代謝物和鑒定匯總


                  2、差異代謝物的鑒別和不同差異代謝物與疾病嚴重程度、病程和年齡的關系

                  同時研究者為了最大程度的鑒別帕金森病患者的不同代謝物,他們構建了一個PLS-DA模型。從圖可以看出,DN-PD的血漿代謝組與HC明顯分離(圖3a)。并且經過進行置換試驗以確保模型沒有過度擬合。在隊列1 的226種代謝物中,75種代謝物對DN-PD和HC的區分具有顯著差異。再進一步使用FDR校準進行Mann-Whitney U試驗,發現60種代謝物發生了顯著變化(圖3b)。其中有50種代謝物被認為是PD中的差異代謝物(圖3c),包括?;鈮A、PCs、FFA、FFA酰胺等43種代謝產物水平下降。7種代謝物(苯乙酰-L-谷氨酰胺、對甲酚葡萄糖醛酸等)的水平在PD中顯著升高(圖3d)?;谶@些在PD中鑒定的差異代謝物,在進一步的通過路徑分析可以發現,在不飽和FFAs生物合成(特別是亞油酸、亞麻酸和花生四烯酸代謝)、類固醇激素生物合成泛酸鹽和輔酶A的生物合成和氨基酸代謝途徑可能參與了PD的發病機理病變過程。

                      通過Hoehn - Yahr (H-Y)分期評估PD研究者發現FFA14:1與疾病的嚴重程度呈正相關。FFA14:1、PC34:2和吲哚乙酸的水平與疾病的持續時間也呈正相關的關系,而FFA 20:5和FFA 16:2則呈負相關。還發現HC和PD中相關的代謝物還顯示出了不同年齡的相關性,其中有醛固酮,泛酸和乙酰甲硫氨酸與HC中的年齡有關,但是與PD中的年齡相關的代謝產物只有1個FFA12:0,基于以上的這些發現可以進一步說明HC和PD具有不同的代謝模式。



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                  圖3 與HC相比,DN-PD中代謝譜的改變


                  3、藥物治療對PD患者血漿代謝的影響

                  對于抗帕金森病的的藥物治療,患者一般會采取不同類型的藥物來治療。所以為了評估藥物可能引起的血漿代謝組學的變化,研究人員又招募了一個獨立的人群,包括DN-PD、左旋多巴治療的PD(DO-PD)、普拉克索治療的PD(PR-PD)以及左旋多巴和普拉克索聯合治療的PD(CO-PD))和HC進行代謝組學分析。從PLS-DA圖可以看出,DN-PD組與DO-PD組沒有存在過度擬合的現象,表明兩組之間存在顯著差異。不過,DN-PD和PR-PD或CO-PD之間的PLS-DA組間并沒有顯示出明顯的分離。這些情況可能說明左旋多巴胺的治療可能對PD患者的代謝產生非常顯著的影響,另外兩種模型都不會產生顯著影響,經過生物統計學分析可以發現與左旋多巴胺治療有關的代謝物有11種,主要包括苯酚硫酸鹽、溶血磷脂酰膽堿(LPC)、PC、SM、L-3甲氧基三氮、苯丙氨酸等。其中經左旋多巴胺治療后,L-3甲氧基酪氨酸水平提高的很明顯,所以可以認為是左旋多巴胺的主要代謝物(圖4b)。相比之下未發現與普拉克索單獨治療相關的代謝物,但發現苯丙氨酸、L-3-甲氧基酪氨酸和PE o-38:6等3種代謝物與聯合治療相關。

                  通過膽汁酸譜可以發現,與HC組相比,PD組患者初級膽汁酸CA、次級膽汁酸DCA以及結合膽汁酸TDCA、GDCA、GDCS、TCAS和GLCAS顯著升高。而且CO-PD組都可以緩解帕金森病患者的BAs升高。不過從PR-PD組來看,經單獨治療后,卻沒有發現膽汁酸明顯的改變。通過計算BAs的比值,研究人員評估了參與BA合成的酶的活性,發現PD中CA/CDCA顯著升高,表明膽固醇代謝發生了改變,從代替途徑轉變為主要途徑。此外,與HC相比,DN-PD患者的BA比值大部分增加,表明藥物治療可以減少膽汁酸的生成。



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                  圖4 判別模型的建立與驗證


                  4、PD與HC和NDC的差異代謝物比較

                  為了進一步驗證PD的代謝變化并確定潛在的生物標志物,研究人員收集了另一組血漿樣本進行代謝組學分析。結果表明,經治療的癲癇患者與HC之間無顯著差異。研究人員繪制的剩下四種代謝物的ROC曲線如圖所示,每種代謝物的AUC值分別為0.702、0.655、0.667和0.700(圖5f),為了提高判別能力,經二元logistic回歸分析,AUC值可以達到0.821。當區分DN-PD和HC時,相應的ROC曲線得出AUC值為0.832(圖5f)。為了驗證診斷模型的有效性,我們還評估了它在其他兩個隊列中的判別能力。如圖5g-h所示,在第2組和第3組中,當區分PD和HC時,ROC曲線對應的的AUC值分別為0.801和0.834。當用于區分PD與HC和NDC,AUC值為0.767(圖5i)。



                  圖片關鍵詞

                  圖5 PD與HC和NDC的差異代謝物比較


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                  結論

                  通過以上的研究,可以發現多不飽和脂肪酸代謝、BA和類固醇激素生物合成、咖啡因代謝和氨基酸代謝中的代謝紊亂是導致PD產生的關鍵代謝因素。微生物群的累積衍生的有害代謝物,包括對甲酚硫酸鹽、對甲酚葡萄糖醛酸和苯乙酰-L-谷氨酰胺,暗示了腸道內穩態在下游神經退行性過程中的重要作用。這些評估有助于提高我們對PD發病機制的認識,有助于篩選治療干預的靶點。而且最終確定的代謝物組可能為帕金森病的臨床診斷提供新的方法。


                  ? 文獻出處

                  Shao Y , Li T , Liu Z , et al. Comprehensive metabolic profiling of Parkinson's disease by liquid chromatography-mass spectrometry. Molecular Neurodegeneration, 2021,16(1).





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