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                  案例分享

                  Scientific Reports丨慢性不可預知輕度應激對大鼠的代謝組學的系統性影響的研究

                  發布日期:2020.05.25

                  代謝組學和醫學研究

                  在醫學領域,代謝組學是以研究臨床整體、器官、組織及細胞的內源性代謝物質的代謝途徑及其所受內在或外在因素的影響及隨時間變化規律為目的,通過揭示代謝組整體變化軌跡來反映某種病理生理過程中所發生的一系列生物事件。能夠在基因解析、病理闡述、藥物設計開發、病變標志物篩選、疾病診斷分型和治療效果預測等醫學相關領域發揮顯著作用。

                  應用案例
                  抑郁癥的代謝組學研究


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                  研究內容簡介

                  抑郁癥又稱抑郁障礙,發病率和死亡率都很高。以顯著而持久的心境低落為主要臨床特征,是心境障礙的主要類型。臨床可見心境低落與其處境不相稱,情緒的消沉可以從悶悶不樂到悲痛欲絕,自卑抑郁,甚至悲觀厭世,可有自殺企圖或行為;甚至發生木僵;部分病例有明顯的焦慮和運動性激越;嚴重者可出現幻覺、妄想等精神病性癥狀。全球共有約4億人患有抑郁癥,少于25%的患者會尋求有效的治療;中國約有9000萬人患有抑郁癥,抑郁癥患者接受治療的大概只有8%,每年有20多萬人因抑郁癥自殺。

                  現代醫學常使用慢性不可預測輕度應激模型(CUMS)模擬臨床抑郁癥的方法對抑郁癥進行研究。而最近的研究表明,這一方法可能導致機體的非穩態超負荷,從而引發系統性疾病,那么,這種變化在代謝物層面是怎么體現的呢?在本次研究中,作者使用非靶向氣相色譜-質譜聯用(GC-MS),結合單維統計分析、多維統計分析和通路分析的代謝組學技術,對慢性不可預測輕度應激模型中主要應激靶向組織(血清、心臟、肝臟、大腦和腎臟)中的代謝生物標志物進行研究。

                   

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                  研究方法
                  1.動物信息

                  168周齡的雄性Sprague-Dawley大鼠(SD大鼠),180-240?g)隨機分為兩組(CUMS組和對照組),每組8只。

                  2.CUMS程序設計

                  設定實驗方案包括:食物不足(24h),水不足(24h),45°籠傾斜(24h),擁擠住房(24h),限制狹小空間(4h),噪音(20min),尾夾(1min),強迫游泳(10min)和晝夜顛倒(12 h / 12 h)。

                  為了確保程序的不可預測性,隨機安排CUMS組大鼠每天接受其中一種,持續4周。采用蔗糖偏好試驗(SPT)和強迫游泳試驗(FST)評價大鼠抑郁樣狀態。行為測試的結果使用平均值+標準差(M±SD)描述,并應用GraphPad 8.0版軟件進行t檢驗。

                  3.樣品收集

                  行為測試后24小時,用1%戊巴比妥鈉(50?mg/kg)麻醉大鼠。采集血液,以5000?rpm離心5?min獲得血清。然后迅速切除大腦,解剖大鼠。用0.9%生理鹽水清洗整個大腦、心臟、肝臟和腎臟樣本,然后將所有樣本在-80°C下冷凍并保存。

                  4.樣本預處理和GC-MS檢測和數據分析

                  將收集好待測的各類樣本(血清和心、肝、腦、腎等組織)根據GC-MS非靶向代謝組學需要進行預處理和進行GC-MS上機檢測。并對于得到的下機數據進行單維統計分析(t-test)、多維統計分析(PCA、PLS-DA、OPLS-DA分析)差異代謝物定性和通路分析(基于KEGG;http://www.kegg.jp)。

                  (詳細方案見原文,譜領生物可提供包含此項的高質量代謝組學服務)。

                   

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                  實驗結果

                  1.行為測試

                  CUMS大鼠在SPT中(57.12%?±?8.22%)的平均蔗糖偏好率明顯低于對照組(88.34%?±?4.82%;n?=?8, p?<?0.0001)。此外,與對照組(106.63?±?7.76?s;n?=?8, p?<?0.0001)相比,CUMS導致FST的平均不動時間延長(162.38?±?9.85?s)。如圖1所示,這說明成功建立了抑郁癥模型。



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                  圖1


                  2. 血清和組織樣本的GC-MS色譜圖

                  1為通過使用GC-MS進行非靶向代謝組學檢測得到的CUMS組和對照組的血清(a)、心臟組織(b)、肝臟組織(c)、腦組織(d)和腎臟組織(e)的代表性GC-MS總離子電流(TIC)色譜圖。



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                  圖2

                                                  

                  3.代謝組學數據的多元統計分析

                  利用GC-MS數據進行OPLS-DA分析和排列試驗以評估OPLS-DA模型。對照組和CUMS組的血清、心臟、肝臟、大腦和腎臟樣本中分別存在10、10、9、47種差異代謝物(VIP?>?1,p?<0.05)。



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                  圖3


                  為了進一步了解CUMS組和對照組之間的代謝差異,對所鑒定的代謝產物的數據進行分析。如圖4所示,盡管樣本簇稍微重疊,但大多數樣本明顯地被分為兩個不同的簇,這與OPLS分析一致。



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                  圖4

                  4.代謝通路分析

                  對差異代謝物進行代謝通路分析(圖4(Raw p < 0.5,Impact > 0),作者列出九條重要的代謝通路:

                  (a)  丙氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸代謝;

                  (b)  苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成;

                  (c)  D -谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝;

                  (d)  精氨酸和脯氨酸代謝;

                  (e)  亞油酸代謝(心臟組織);

                  (f)   甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝(肝臟組織);

                  (g)  亞油酸代謝(腎臟組織)

                  (h)  氨?;?/span>-轉錄RNA生物合成;

                  (i)   甲烷代謝。

                  這幾條代謝通路主要與氨基酸、脂質、能量、核苷酸代謝相關。

                   

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                  結果討論

                  對照組和CUMS組的血清、心臟、肝、腦和腎組織中分別檢測到10、10、9、47種差異代謝物。如圖5所示,這些代謝物生物標記物涉及9個代謝通路,主要與氨基酸、脂質、能量和核苷酸代謝有關。如圖6所示,這些生物標志物彼此密切相關。



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                  圖5


                  1.  氨基酸及其代謝產物

                  氨基酸及其代謝產物是許多代謝途徑的基本底物和調節因子。氨基酸水平的改變被認為是精神分裂癥、老年癡呆癥和2型糖尿病的危險標志。在此次研究中,作者發現與對照組相比,CUMS組的L-丙氨酸、L-谷氨酸、甘氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-纈氨酸、L-異亮氨酸和L-去亮氨酸發生了顯著變化。丙氨酸在CUMS大鼠血清和心臟組織中均升高,被認為是抑郁癥與心血管疾病的聯系之一。L-丙氨酸直接參與糖異生和丙氨酸-葡萄糖苷循環,調節葡萄糖代謝。與γ-氨基丁酸、?;撬岷透拾彼嵋粯?,L-丙氨酸作為一種抑制性神經遞質參與淋巴細胞的繁殖和免疫,但L-丙氨酸與抑郁癥的關系仍需進一步研究。谷氨酸,又稱谷氨酸,由谷氨酰胺水解而得,是細胞代謝的關鍵分子。谷氨酸和谷氨酰胺是主要天然抗氧化劑谷胱甘肽(GSH)的前體,在維持細胞氧化還原平衡方面發揮重要作用。但是,在此次研究中,CUMS大鼠的血清谷氨酸水平升高,結果與之前的研究不一致,此外,一項早期的研究也使用GC-MS來評估慢性不可預測輕度應激模型大鼠的四個腦區??偟膩碚f,谷氨酸的紊亂可能是由于谷氨酰胺-谷氨酸循環的紊亂,這可能是抑郁癥發病的部分原因。L-蘇氨酸和甘氨酸參與甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝。甘氨酸是一種半必需氨基酸和基本營養素。甘氨酸作為內源性抗氧化劑GSH的組成部分,參與了氧應激和與抑郁相關的細胞膜損傷過程。在研究中,心臟和肝臟L-蘇氨酸升高和心臟甘氨酸降低與甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝異常有關。苯丙氨酸是一種必需的氨基酸和兒茶酚胺的前體,兒茶酚胺是神經遞質和腎上腺素樣物質,在抑郁癥中起著至關重要的作用。纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸是支鏈氨基酸(BCAAs),參與應激、能量產生和肌肉代謝。纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸水平的異常在首發精神病中有記錄。此次研究還證明纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸水平的異常變化與抑郁癥有關。

                   

                  2.  脂肪酸

                  此前有研究表明抑郁障礙患者的腦內多不飽和脂肪酸(PUFA)比率和單不飽和脂肪酸(MUFA/飽和脂肪酸(SFA)含量(如二十二碳六烯酸,C22:6n-3;油酸,C18:1;棕櫚酸,C16:0;硬脂酸,C18:0)發生變化,這可能是病理發生和發展的基礎。在此次研究中,作者發現在血清和肝組織中亞油酸代謝紊亂。亞油酸是花生四烯酸(a a)的前體,與炎癥、2型糖尿病和心血管疾病有關。炎癥和氧化應激在抑郁癥發病機制中起著重要作用。此外,核紅細胞相關因子2Nrf2)參與代謝穩態和炎癥反應,已成為抑郁癥防治的一個有前途的靶點。早期的研究表明,魚油和共軛亞油酸可誘導Nrf2的上調,并在大鼠抑郁模型中評價了它們的保護作用。CUMS組大鼠亞油酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸酰胺和棕櫚烯酸的水平與對照組大鼠相比發生了顯著變化,這一發現可能有助于理解導致抑郁的炎癥和氧化應激的分子機制。

                   

                  3. 甲烷代謝

                  此次研究首次發現CUMS會導致抑郁大鼠腎臟甲烷代謝紊亂。在全球碳循環中,甲烷主要由甲烷氧化菌和產甲烷菌代謝。在厭氧條件下,產甲烷菌可以通過將有限數量的底物轉化為甲烷來獲得生長所需的能量。在研究中,L-絲氨酸參與甲烷代謝,這突出了L-絲氨酸在細胞增殖和生長中的重要性。因此,腎臟正常甲烷代謝的紊亂可能會對中樞神經系統產生不利影響,導致抑郁。然而,目前還沒有足夠的證據表明甲烷代謝對抑郁癥的影響,還需要進一步的研究。

                   

                  4.  丙酮酸在CUMS組大鼠腦內的代謝

                  此次研究發現丙酮酸在CUMS大鼠腦內的代謝可能受到干擾,雖然結果并不顯著,但由于其高的影響價值,仍然值得注意。丙酮酸是糖酵解的最終產物,是氧化代謝的主要底物,也是葡萄糖、乳酸、脂肪酸和氨基酸合成的研磨點。大腦是一個極其復雜和高度代謝的器官,幾乎完全依賴葡萄糖和丙酮酸代謝來產生細胞能量。大腦對ATP有很高的需求,由于其主要依賴碳水化合物代謝來產生ATP,所以受影響最大的是所有組織。丙酮酸代謝異常在癌癥、心力衰竭和神經退行性變中起著特別重要的作用。但此次研究由于樣本量太小,作者無法檢測出丙酮酸代謝的真正顯著差異。因此,作者認為了解和開發丙酮酸代謝可能產生新的治療方法。



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                  圖6


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                  總結

                  在此次研究中,作者使用GC-MS平臺,結合多維統計分析,來描述主要應激靶向組織(血清、心臟、肝臟、大腦和腎臟)的代謝特征,以全面了解血清和各個組織對慢性不可預測輕度應激誘導的反應。研究結果強調了慢性不可預測輕度應激組(CUMS組)與對照組大鼠相比,體內代謝產物和生化途徑的不同,有助于理解慢性不可預測輕度壓力誘導的抑郁的病理生理機制。


                  ? 文獻出處

                  Geng C, Guo Y, Wang C. et al. Systematic impacts of chronic unpredictable mildstress on metabolomics in rats.Scientific Reports, 2020 .



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