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                  Science子刊丨代謝組學研究發現發熱伴血小板減少綜合征與精氨酸代謝異常有關

                  發布日期:2020.06.10



                  代謝組學和醫學研究

                  醫學代謝組學,顧名思義是以研究疾病的發病機理、診斷分型以及早期預測為目標的代謝組學技術。代謝物是遺傳信息表達的最終產物,基因和蛋白質表達的微小變化通常引起代謝物層次的巨大變化。作為主流代謝組學平臺的色譜質譜聯用技術具有高靈敏度和高特異性優點。因此代謝組學是目前疾病表型研究最靈敏的組學技術之一。


                  應用案例
                  對精氨酸缺乏的代謝組學研究


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                  研究內容簡介

                  2009年,中國首次發現發熱伴血小板減少綜合征(SFTS),多省市發生過地方聚集性疫情。該病住院患者病死率高達12-30%,近年在高發省份發病率呈現逐漸增長的趨勢。該病是一種蟲媒病毒性出血熱,一般以發熱伴呼吸道或消化道急癥起病,初始癥狀與流感等病毒性感染疾病不易區分,隨即出現血小板和白細胞進行性下降。其臨床特征包括高熱、血小板和白細胞減少、出血、胃腸道癥狀及多臟器功能衰竭。目前尚無疫苗,也缺乏有效的臨床干預手段,是傳染病研究中的一個難題。世界衛生組織已經將發熱伴血小板減少綜合征(SFTS)病毒列為最需要關注的病毒之一。本篇文獻作者采用代謝組學技術對這一疾病的致病機制進行研究。而在之前的研究中,作者已經確定精氨酸代謝是參與SFTS病毒(SFTSV)與宿主應答相互作用的關鍵途徑。精氨酸是一種非必需氨基酸,其代謝不僅具有重要的創面愈合功能,還與宿主免疫反應相結合,與骨髓衍生抑制細胞(MDSC)相關。MDSC對精氨酸代謝的調節作用已在多種慢性感染如HIV和單純皰疹病毒感染中得到證實。然而,MDSC相關的精氨酸剝奪或整體代謝變化在急性病毒感染中尚未被很好地描述。因此,為了確定補充精氨酸是否可以逆轉病毒引起的發病機制改變并提供臨床益處,作者對SFTS患者進行了隨機對照試驗,并研究了精氨酸在該病臨床發展過程中的有效性。


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                  研究方法

                  采用病例對照研究,確定SFTS感染的特異性差異代謝產物。共抽取46名SFTS患者、46名健康對照組和46名非SFTS發熱對照組進行代謝組學分析,并驗證精氨酸代謝紊亂及其生物學效應。對44例SFTS患者和48例健康對照者進行血小板、免疫表型及氨基酸含量的檢測。

                  最后,選擇53例和60例SFTS患者分為精氨酸治療組和安慰劑組,進行隨機、單盲、安慰劑對照試驗,以驗證精氨酸給藥的效果。


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                  實驗結果

                  代謝組學分析

                  為了確定與SFTSV感染相關的代謝紊亂,作者使用基于液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)的代謝組學方法對兩組獨立患者血清中代謝物進行檢測分析,在242份臨床樣本中共測到了166種代謝物(第一組為46例急性感染和成對恢復期樣本,對照組為46例健康對照組和46例非SFTS發熱組;另一組為10例死亡對照組和10例存活對照組,對照組為16例健康對照組)。通過使用正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)和主成分分析(PCA)模型(圖1、A和B),該靶向代謝組學分析能夠區分急性SFTSV感染與健康對照組和非SFTS、發熱性疾病,也能區分致命和存活病例,A和B)。在通過單因素方差分析(ANOVA)對代謝物[組間比較的可變重要度(VIP)值>1或P<0.05]進行篩選后,層次聚類顯示組間的代謝特征不同(第一組63種不同代謝物,第二組80種不同代謝物,54種不同代謝物兩組共同的差異代謝物(圖1,C和D)。



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                  圖1


                  使用Metaboanalyst3.0在線工具(16)對改變的代謝物進行代謝途徑分析(MetPA),揭示精氨酸代謝途徑的變化最為顯著(圖1E)。通過提取精氨酸相關代謝物的相對濃度(RCs),作者發現,與健康對照組相比,精氨酸RC在SFTS急性期顯著降低(P<0.001)(圖1F)。此外,死亡病例的精氨酸濃度甚至低于存活病例(圖1G)。精氨酸RC在存活病例的恢復期明顯恢復,而在死亡病例的惡化期無明顯恢復。苯丙氨酸的趨勢則相反,這表明精氨酸RC的減少是由于下游分解代謝的改變,而不是蛋白質降解的嚴重損害,因為苯丙氨酸可以作為蛋白質降解的反映。精氨酸可以被一氧化氮合成酶(NOSs)催化為一氧化氮(NO)和瓜氨酸,瓜氨酸RC也與臨床結果相關(死亡惡化與存活恢復的比值P=0.002)。由此,作者認為精氨酸代謝在對SFTSV感染的反應中被改變,并可能會促進病毒的致病過程并惡化患者的預后。


                  精氨酸缺乏使血小板內一氧化氮(NO)濃度降低,血小板減少

                  由于有研究表明精氨酸/一氧化氮代謝途徑減弱可能導致血小板功能障礙,作者研究了患者血小板中一氧化氮合酶活性是否影響疾病進展。首先,作者分析了SFTS患者血小板單細胞水平上血小板內一氧化氮(Plt-NO)的生物合成。和預期相符,Plt-NO顯著降低(P=0.004)(圖2A),與同一時間點測得的血小板計數呈正相關(圖2B)。作為NO的前體,在早期1天測得的精氨酸濃度與血小板計數具有相似的相關性(圖2C)。研究表明,精氨酸/NO是抑制血小板活化的重要途徑之一。作者發現精氨酸濃度與血小板活化呈負相關,由PAC-1(活化整合素αIIb/β3)表達反映(圖2D),這在SFTS患者中也升高(P=0.009)(圖2E),表明血小板丟失可能與SFTSV感染時血小板活化有關。

                  進一步的研究發現血小板單核細胞復合物(PMC)和血小板凋亡的頻率顯著增加(P=0.007和P<0.001)(圖2,F和G),這表明血小板過度活化可能有助于減少循環中的血小板計數。此外,精氨酸在體外可適度減輕SFTSV誘導的血小板活化,而NOS抑制劑Nω-硝基-L-精氨酸甲酯鹽酸鹽可減弱精氨酸對血小板活化的抑制作用(圖2H)。

                  根據這些結果,作者認為精氨酸對血小板穩態的調節作用類似于慢性心血管疾病,可能通過精氨酸/氧化氮途徑實現,低精氨酸血癥可能與血小板減少有關。



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                  圖2


                  髓源性抑制細胞(MDSC)擴增和精氨酸剝奪對T細胞免疫功能的影響

                  由于與精氨酸剝奪相關的T細胞受MDSC調控,作者檢測了CD3-ζ鏈在T細胞中的表達水平,結果發現T細胞中CD3-ζ鏈表達減少(圖3A,B),且CD3-ζ鏈對免疫調節的影響與T細胞亞群和病毒載量呈負相關(圖3C)。對39例急性SFTSV感染患者和35例健康對照組新鮮外周血中粒細胞性MDSC (gMDSC)和單核細胞性MDSC (mMDSC)的表達頻率進行了評估。在所有外周血單個核細胞(PBMC)亞群中,擴增的gMDSC表達了細胞內最高的精氨酸酶濃度,并且在18例SFTS患者中觀察到精氨酸酶+ gMDSC與PBMC的比值升高(圖3G)。在這些病例中,gMDSC表面CD63表達頻率也更高(圖3H),表明gMDSC有脫顆粒和釋放精氨酸酶I的趨勢。此外,gMDSC的擴增與血清精氨酸酶I濃度升高同時發生,gMDSC頻率與循環精氨酸濃度呈負相關(圖3J),以及循環精氨酸濃度與病毒載量呈負相關(圖3K)。

                  由此,作者認為SFTSV誘導 gMDSC通過精氨酸酶減少精氨酸,造成SFTSV感染T細胞、CD3-ζ鏈損傷,從而導致T細胞反應障礙。



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                  圖3


                  氨基酸靶向檢測

                  為了驗證精氨酸及其相關代謝物的系統變化,作者對44例SFTS患者的血清氨基酸進行了定量分析。與30名對照組樣本相比,急性SFTS患者的精氨酸和瓜氨酸濃度顯著降低(P均< 0.001),而鳥氨酸濃度升高(P = 0.043)(圖4,A至C)。

                  同樣,在SFTS患者中,鳥氨酸/精氨酸比例升高,而瓜氨酸/精氨酸比例略有下降(圖4、D和E)。這些結果證實精氨酸代謝傾向于優先產生尿素/鳥氨酸,而不是一氧化氮(NO)。研究發現,以精氨酸/(鳥氨酸+瓜氨酸)計算的整體精氨酸生物利用度(GABR)在SFTS患者中顯著降低(圖4F),在SFTS致死患者中甚至更低(圖4G)。



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                  圖4


                  補充精氨酸對臨床和實驗室指標的影響

                  為了證實這些結果,作者隨后通過隨機對照試驗探討了補充精氨酸是否可以改變SFTSV感染疾病進展或結果。篩選出53 名接受精氨酸治療的患者(精氨酸(20 g /天,靜脈注射葡萄糖)加維持療法)和60名對照患者(只進行維持療法)。

                  生存分析顯示,與對照組相比,精氨酸治療組的血小板恢復速度加快至正常值【調整危險比(HR) =1.508;95%置信區間(CI),1.010 ~ 2.254;P =0.045】(圖5C)。此外,接受精氨酸治療患者T細胞CD3-ζ鏈的表達顯著增加(圖5,D和E),表明T細胞CD3-ζ鏈表達的恢復可能與精氨酸補充有關。



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                  圖5


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                  結果討論

                  SFTS病例中精氨酸缺乏,提示NOS和精氨酸酶對精氨酸的分解代謝是SFTSV感染及死亡的重要途徑。精氨酸缺乏與Plt-NO濃度降低有關,可能與血小板活化和血小板減少有關。SFTSV感染后,表達精氨酸酶的MDSC擴張,與T細胞CD3鏈下調和病毒清除障礙有關,提示精氨酸酶活性和精氨酸耗竭在抗SFTSV T細胞功能損害中的作用。GABR測定可被認為是一種更全面的NO合成能力降低的測定,同時作者認為,SFTS死亡率的有效預測因子應該測定整體精氨酸生物利用度(GABR),而不是精氨酸濃度。在一個獨立的SFTS患者組上進行的隨機對照試驗表明,精氨酸的應用與提高Plt-NO濃度、抑制血小板活化、提高CD3鏈表達和血小板計數相關,最終達到加速清除病毒的目的。

                  1.NOS在血小板中的表達和功能

                  眾所周知,NO調節血小板功能并刺激血小板中可溶性鳥苷環化酶,導致鳥苷-3',5'-環單磷酸(cGMP)增加,從而激活cGMP依賴性蛋白激酶。這反過來又通過各種途徑抑制血小板活化,例如NO抑制磷脂酰肌醇3激酶的活化,并引起GPIIb-iia纖維蛋白原受體(PAC-1表達)的活化。據報道,低濃度的精氨酸可直接損害血小板的一氧化氮合成,導致血小板的高聚集性。然而,這一途徑的重要性主要局限于心血管疾病。本次研究提供了重要的數據表明,SFTS患者血小板精氨酸缺乏和隨后的NO下調可能參與血小板活化,這可能與血小板單核細胞聚集和血小板凋亡有關,從而在血小板清除和血小板減少的發生發展中起到作用。

                  2. 精氨酸代謝紊亂參與了MDSC的擴張

                  有研究證實MDSC在腫瘤浸潤中擴張,并通過產生精氨酸酶I(排出精氨酸)下調局部和全身免疫反應。近年來,研究人員還發現,MDSC通過限制包括T細胞和自然殺傷細胞在內的幾種免疫細胞的功能,有效地抑制抗病毒宿主免疫。因此,作者認為gMDSC與SFTS中精氨酸消耗之間存在聯系,并對T細胞亞群的有抑制作用。隨后的隨機對照試驗進一步證實了這一結論,在給予精氨酸后,血小板活化和抑制的T細胞CD3鏈表達均得到糾正,顯示其對實驗室異?;謴秃蜏p輕臨床預后的潛在有益作用。然而,為了避免影響血壓,隨機對照試驗設計僅限于治療輕度病例,因此,精氨酸在降低病死率方面的作用仍需要探索。


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                  分享討論

                  本次研究中,作者揭示精氨酸在治療具有類似發熱伴血小板減少綜合征(SFTS)臨床特征的傳染病方面的潛力值得探索。而進一步的代謝組學研究也有望為其他新出現的傳染病找到新的治療靶點,體現了代謝組學作為一門新技術,在臨床研究和新型治療靶點發現的研究中也可以起到重要作用。



                  ? 文獻出處

                  Li XK, Lu QB, Cao WC. et al. Arginine deficiency is involved in thrombocytopenia and immunosuppression in severe fever with thrombocytopenia syndrome. Science Translational Medicine2018, 10, eaat4162. 

                  DOI: 10.1126/scitranslmed.aat4162.



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