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                  案例分享

                  ?Sirtuin 5通過脫戊二酰依賴的方式促進谷氨酰胺分解進而參與結直腸癌的發生

                  發布日期:2019.12.31

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                  研究背景


                  腫瘤的異常代謝特征被認為是癌癥的一個標志,并已成為新的治療策略的一個有吸引力的靶點。結直腸癌(CRC)是全球第三大最常見的惡性腫瘤,也是癌癥相關死亡的第四大原因。結直腸癌(CRC)在腫瘤發生過程中也表現出不受調控的代謝特征。今天小編就和大家一起來探究一下結直腸癌到底是如何發生的呢?

                  前言


                  有研究表明代謝酶可以被許多蛋白質翻譯后修飾(PTMs)所調控,包括乙?;?、琥珀?;?、丙二?;?、戊二?;?、甲基化、丙?;?、丁?;桶投辊;?。

                  而Sirtuin5(SIRT5)作為sirtuin家族的一員,是賴氨酸琥珀?;?、丙二?;臀於;娜蛘{節因子,它顯示出低或不可檢測的脫乙?;钚?。這三種新的ptm被歸類為短鏈賴氨酸?;磻?,它們類似于賴氨酸乙?;磻?,但在疏水性、電荷或碳氫鏈長度方面不同。異檸檬酸脫氫酶2(IDH2)的脫羧作用和SITR5葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的脫戊化作用導致細胞活性氧水平降低,從而保護細胞免受氧化損傷。SIRT5靶點活性的改變,如丙酮酸脫氫酶復合物和琥珀酸脫氫酶,都與癌細胞代謝失調有關。

                  作者首先通過大規模的蛋白質組分析來確定SIRT5的各種代謝靶點,但是關于SIRT5在惡性腫瘤中調節的整體代謝變化的研究很少。于是選擇通過高通量氣相色譜-質譜(GC-MS)篩選和基于13C的代謝通量分析,確定谷氨酰胺依賴的三羧酸(TCA)循環回補是SIRT5調控大腸癌細胞的主要代謝途徑。還揭示了SIRT5對GLUD1脫戊?;凸δ芗せ畹恼{節作用。表明SIRT5是大腸癌潛在的治療靶點。

                  研究方法


                  本文采用非靶向代謝組學分析,代謝流分析,RNA干擾技術,流式細胞術分析,蛋白印跡法,細胞增殖和克隆形成分析,定量實時逆轉錄聚合酶鏈反應,免疫熒光法等研究方法。這里小編給大家著重介紹一下其中的非靶向代謝組學分析及代謝流分析。

                  代謝組學分析


                  由于SIRT5對腫瘤發生的促進作用依賴于其催化活性,這種催化活性可能調節細胞代謝,為了確定SIRT5是否對CRC代謝重編程有影響。作者在SIRT5已經被沉默的HCT116細胞中提取代謝物進行GC-MS分析。如圖1a所示,在進行偏最小二乘判別分析(PLS-DA)時,可以觀察到對照細胞和SIRT5 siRNAtransfected細胞之間的分布模式對比。


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                  圖1

                  差異豐富代謝物的代謝物集富集分析顯示,SIRT5下調導致TCA循環和谷氨酰胺代謝發生深刻變化(圖1b),包括谷氨酸豐度增加和α-酮戊二酸(α-KG)水平降低。

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                  圖2

                  伴隨著幾乎所有TCA循環中間產物的急劇減少(圖2a)。如圖2b所示,谷氨酰胺被代謝為α-KG,它提供碳的臨界入口點,為TCA循環提供燃料,并支持癌癥中的合成代謝過程。這些結果使我們假設SIRT5可能在調節腫瘤谷氨酰胺代謝中起作用,從而影響TCA循環代謝產物的豐度。

                  為了確定SIRT5是否影響谷氨酰胺攝取,我們測量了SIRT5沉默后細胞培養液中谷氨酰胺的含量。

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                  圖3

                  在HCT116和LoVo細胞系中,谷氨酰胺的消耗量保持相對恒定(圖3c)。然后確定谷氨酰胺轉換是否改變。用均勻的13C標記谷氨酰胺([U-13C5]谷氨酰胺)監測SIRT5沉默后谷氨酰胺進入TCA循環中間產物的情況。監測發現在24小時時,達到代謝和同位素穩定狀態。

                  為了排除細胞生長引起的代謝變化,在隨后的實驗中使用LoVo細胞系,因為在該細胞系中,SIRT5缺失在SIRT5敲除后的24小時不抑制細胞增殖。結果顯示,并不影響[U-13C5]谷氨酰胺并入谷氨酸(圖3d);但是,它顯著降低了α-KG(m+5),這表明谷氨酸水平的升高不是由合成增強引起的,而是由于α-KG轉化率降低。

                  如圖3f所示,在SIRT5沉默時,琥珀酸(m+4)、富馬酸(m+4)、蘋果酸(m+4)、檸檬酸(m+4)和異檸檬酸(m+4)的部分被抑制。除了TCA循環中間產物外,我們還觀察到谷氨酰胺對天門冬氨酸和天門冬酰胺的貢獻顯著降低,天門冬氨酸和天門冬酰胺是主要通過TCA循環從谷氨酰胺中衍生的非必需氨基酸(NEAA)(圖3g)。

                  作者又進一步測試了谷氨酰胺衍生丙酮酸和乳酸的水平。如圖3h所示,雖然丙酮酸和乳酸的一小部分來自谷氨酰胺(<5%),但抑制SIRT5導致丙酮酸(m+3)和乳酸(m+3)輕微但顯著減少。

                  在LoVo細胞中觀察發現SIRT5的過度表達顯著增加了m+5α-KG的比例(圖3i),并促進了[U-13C5]谷氨酰胺在m+4標記的TCA循環中間產物中的較高摻入率,同時伴有谷氨酰胺衍生的天門冬氨酸和天門冬酰胺(圖3j)。然而,酶缺陷突變體并沒有表現出所有這些功能,這表明SIRT5的催化活性是促進谷氨酸轉化為α-KG所必需的。

                  為了準確監測還原性谷氨酰胺代謝,我們使用[1-13C]谷氨酰胺進行了代謝通量分析,該谷氨酰胺僅通過還原性羧化途徑將碳轉移到檸檬酸鹽。雖然觀察到α-KG(m+1)的顯著變化,但SIRT5的敲除和過度表達均未改變來源于谷氨酰胺的標記m+1蘋果酸、富馬酸和天冬氨酸的水平。因此,我們證明SIRT5主要調節CRC細胞的氧化谷氨酰胺代謝,但對還原羧基化途徑沒有明顯的影響。

                  綜上所述,這些結果支持這樣的觀點,即SIRT5以去乙?;閷У姆绞教岣逤RC細胞的谷氨酰胺利用率,從而增加TCA循環中碳的補充,并可能導致SIRT5誘導的CRC增殖。

                  之后,作者又用穩定表達控制載體SIRT5-WT和SIRT5-H158Y的HCT116細胞在裸鼠體內建立了異種移植瘤模型,評估腫瘤生長情況,實驗結束時,對異種移植瘤組織切片進行GLUD1酶活性分析。SIRT5-WT的過度表達顯著加速了結直腸癌的發生。

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                  圖4

                  此外,作者發現當GLUD1在SIRT5-高表達腫瘤中被抑制時,異種移植研究顯示腫瘤生長延遲,腫瘤大小和質量降低,這表明GLUD1基因敲除顯著抑制了SIRT5誘導的腫瘤生長。相反,SIRT5基因敲除異種移植物小鼠的結直腸癌發生率降低,腫瘤體積和重量降低。對腫瘤裂解物的GC-MS分析還顯示,SIRT5沉默導致TCA循環代謝物顯著下調,包括α-KG、琥珀酸、富馬酸、蘋果酸、檸檬酸和異檸檬酸(圖4)。因此,得出SIRT5通過激活GLUD1進而增強TCA循環流量而導致CRC惡性表型的模型。

                  結論


                  癌癥代謝的一個共同特點是能夠獲得和利用營養物質以滿足快速增殖的需要。在這項研究中,作者證明了SIRT5在結直腸癌代謝重編程中的關鍵作用,發現SIRT5的過度表達通過以脫戊?;蕾嚨姆绞郊せ頖LUD1促進谷氨酰胺合成代謝,并與CRC細胞增殖、存活和異種移植瘤生長相關。

                  谷氨酰胺代謝增強促進惡性細胞大分子生物合成。在本研究中,作者證明谷氨酰胺代謝在結直腸癌的翻譯后水平上受SIRT5調控。研究結果表明,SIRT5沉默阻止了谷氨酸形成α-KG,進而抑制谷氨酰胺衍生代謝產物進入TCA循環,從而減少合成代謝的前體。顯示SIRT5是一種腫瘤谷氨酸分解的調節因子,通過其以去谷氨酸依賴的方式激活GLUD1,提示SIRT5是一種有前途的選擇性殺傷癌細胞的抗結直腸癌靶點。這些發現支持SIRT5的致癌作用,使其成為一個可能的結直腸癌生物標志物。


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