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                  案例分享

                  應用代謝組學和蛋白組學相結合的方法研究血管抑郁的小鼠模型

                  發布日期:2019.10.30

                  研究背景


                  抑郁癥是現代社會常見的心理健康問題,其癥狀主要表現為對周圍活動的悲傷和失去興趣或樂趣?;颊呓洺胸撟锔?,自卑,睡眠質量差,食欲不振,疲勞,注意力減少,有時還會自殺。血管性抑郁癥(VD)是抑郁癥的一種亞型,是由血管疾病或腦血管危險因素引起的。近年來,VD患者的比例明顯增加,嚴重影響了患者的生活質量。然而,目前VD的發病機制尚未完全了解,基礎研究也不充分。

                  研究方法


                  在本研究中,作者以LC?MS為基礎的蛋白質組學和代謝組學相結合的方法,研究小鼠VD模型中的蛋白質以及代謝的調控網絡。使用代謝組學和蛋白質組學分析結合ITRAQ方法在VD小鼠的海馬樣品中檢測到44種差異代謝物和304差異蛋白。通過關聯和整合分析構建了一個蛋白-代謝調控網絡。然后定量地驗證了生物信息學分析中顯示的雙分子的水平,使用LC?MS/MS和Western blotting驗證結果表明了神經可塑性、神經遞質運輸、神經元細胞的調節發生了變化,增殖和凋亡,氨基酸,脂質和能量代謝紊亂。參與這些途徑的蛋白質和代謝物將為研究VD的機制提供一個更有針對性和可信的方向。因此,本文提出了一種應用于整合蛋白質組學和代謝組學的方法和策略,用于研究和篩選VD的潛在生物標志物,在缺乏足夠基礎研究的領域可以更加精確和可靠。

                  圖片關鍵詞

                  圖1 實驗設計

                  共有57只小鼠分成假手術組和模型組,其中假手術組26只,模型組31只。行為學實驗結束后立即斷頭處死。取出海馬體。每組樣品中,6只小鼠的海馬用于蛋白質組學分析和Western blot分析,然后6只用于代謝組學分析,10只用于代謝物靶向驗證。

                  實驗結果


                  代謝組學實驗采用1290/6538LC-QTOF/MS進行樣本檢測,然后再用simca和spss等數據分析軟件進行數據分析。得到結果如下:

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                  經過分析鑒定后得到如下差異代謝物:

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                  在做完非靶向代謝組學之后采用ITRAQ方法進行蛋白組學的分析,經過檢測分析,得出200個差異蛋白。為了弄清VD的發病機制,作者采用IPA分析方法對非靶向代謝組學和蛋白組學得到的結果進行整合分析,結果如下:

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                  可以看出小鼠VD引起多種信號通路的改變,如突觸時程增強,與免疫應答相關的通路的變化,神經調節的改變以及氨基酸轉運等。經過進一步分析看出這些差異表達的蛋白質涉及細胞間的信號傳導和相互作用,神經系統發育和功能,行為和神經系統疾病,氨基酸代謝,細胞功能和維持,細胞死亡和存活,脂質代謝和核酸代謝。

                  為了驗證非靶向代謝組中鑒定的物質的準確性,作者挑選了其中的10種物質采用Agilent1290結合AB SCIEX6500進行定量 ,這10種物質如下:

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                  實驗驗證


                  除了代謝組學之外,蛋白組層面也選擇了一些蛋白采用WB方法進行驗證。經過代謝組學和蛋白組學結合IPA分析得到VD小鼠的疾病代謝機制,總結如下圖:

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                  谷氨酸作為中樞興奮性神經遞質,參與中樞神經系統的信息傳遞。雖然谷氨酸能神經元在一些病理條件下,如帕金森病,會過度釋放谷氨酸,導致細胞外谷氨酸水平增加,并產生興奮性毒性,但研究報告稱,慢性不可預見性抑郁癥的海馬顯示出多種神經遞質水平的顯著降低,包括谷氨酸。分析還顯示,與正常組相比,抑郁癥組的谷氨酸水平顯著降低。其原因是多方面的,包括神經遞質內吞和外排。神經遞質通過轉運蛋白的囊泡被運送到胞外,研究發現兩種轉運蛋白SLC17A6和SLC17a7的水平在實驗組中呈下降趨勢,表明實驗組神經遞質的運輸在開始時存在異常。隨后,在實驗組中觀察到SYT1,SYT7和RIM蛋白水平的下降,其中SYT1和SYT7是突觸結合蛋白,而RIM是突觸膜胞吐蛋白。所有這些蛋白都參與了囊泡的初始化以及神經遞質的自發和誘導釋放。在釋放神經遞質之后,囊泡向內融合是由內吞相關蛋白(AP-2,clathrin)誘導形成的空泡。同時,在H+酸化和ATP6v0a1的作用下,囊泡繼續運輸神經遞質,構成完整的囊泡運輸周期。在這個周期的每一步中,一些關鍵蛋白質的水平在實驗組中下調,從而影響整個細胞外排過程的效率,并最終影響神經遞質的傳遞。另一方面,谷氨酸受體蛋白水平減少也是抑郁癥狀發生不可忽視的因素。更多的證據表明,NMDA受體在抑郁癥的病理生理機制中在谷氨酸神經遞質的傳遞中起關鍵作用。谷氨酸受體轉運體水平和功能的降低導致谷氨酸攝取減少和興奮效應降低。抑郁的部分原因是突觸上谷氨酸受體數量的減少。

                  神經遞質傳遞和囊泡循環的過程是一個耗能的過程,需要線粒體的能量供應。有證據表明線粒體參與了腦損傷后神經元凋亡的調節。線粒體功能異常導致線粒體氧化應激和活性氧產生,導致炎癥反應和神經元凋亡,這種現象主要表現在參與線粒體功能調節的多種酶的水平上。其中,Ndufs7和Nduf11主要參與復合物I的氧化磷酸化途徑,提供氫離子。ATP6v0a1和ATPase參與線粒體復合體V的ATP合成。ATPIF1是一種ATPase抑制劑,其增加將顯著抑制ATPase活性。另一方面,與能量相關的代謝物包括L-谷氨酸,檸檬酸,乳酸,精氨酸在模型組也降低了。因此,當VD發生時,這些酶(Ndufs7,Nduf11,ATP6v0a1,ATPase,ATPIF1,ACly,Slc8A2)與代謝產物一起導致線粒體氧化磷酸化。從而影響ATP的合成,引起整個能量代謝障礙。

                  一些氨基酸和蛋白質共同參與穩態調節,在中樞神經系統(CNS)中,谷氨酸和天冬氨酸對維持神經系統穩態最重要。在正常情況下,被過量谷氨酸神經遞質刺激的突觸后膜向突觸前膜發送反饋信號以減少谷氨酸的釋放。過量的谷氨酸和N-乙酰-L-天冬氨酸(NAA)形成N-乙酰-L-天冬氨酸-L-谷氨酸(NAAG)。NAAG存在于突觸前膜,是突觸中一個主要的短期谷氨酸的來源。當受體蛋白下調,反饋調節減弱時,NAAG被N-乙?;摩?連接酸性酶(NAALADase)切割成NAA和谷氨酸。NAAG作為哺乳動物海馬中的內源性多肽,具有抗NMDA受體效應,并起到阻斷神經遞質效應的作用。VD組谷氨酸水平降低,NAAG水平升高。作者推測,NAAG的上調加劇了興奮性神經遞質的傳導和作用,并且由于疾病的發生,負反饋調節作用可能不起作用。精氨酸作為哺乳動物必需的氨基酸之一,在許多生理過程中起著重要作用,如DNA和蛋白質合成,清除活性氧(ROS),抑制自噬,細胞增殖與脂質代謝。此外,精氨酸也與免疫功能的調節有關。在本研究中疾病組的氨基酸水平改變是假手術組的0.85倍,說明影響了精氨酸涉及的途徑。經過分析發現與腦細胞個體死亡和神經退行性疾病發生有關的途徑和功能被上調,與細胞增殖和存活、免疫調節相關的B細胞受體信號轉導、核苷酸合成和脂質代謝有關的途徑和功能被抑制。

                  實驗結論


                  總的來說。在VD疾病狀態下,海馬生物分子的變化主要與神經遞質傳遞的內部失衡有關。一方面,興奮性神經遞質及其下游蛋白水平的下調導致一系列信號通路和神經功能的紊亂,如神經可塑性降低,鈣信號通路異常,神經細胞增殖和凋亡失衡,這些都與抑郁癥的發生密切相關。另一方面,在VD狀態下,作者發現神經遞質內吞和攝入量導致了氨基酸、脂質和能量代謝異常,以及其他功能障礙和異常。






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