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                  案例分享

                  血漿代謝組學研究表明,改變tRNA和生物能可以改善肺動脈高壓的預后

                  發布日期:2019.10.21

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                  研究背景


                  肺動脈高壓(PAH)可導致肺血管阻力增加、右心室功能障礙、和早死,是一種高死亡率的異質性疾病。

                  運用超高效液相色譜-質譜技術,能夠檢測和相對定量檢測微量生物樣本中數百種獨特的代謝物,并構建廣泛的代謝網絡途徑。這些代謝物可以區分生理和疾病狀態。目前,很少對肺血管疾病患者進行代謝組學研究。下面小編和大家分享的文獻,從多環芳烴患者肺組織中發現了異常氧化以及精氨酸和鞘氨醇代謝途徑差異,通過呼出的揮發性化合物區分了嚴重特發性多環芳烴患者和健康志愿者。

                  實驗設計


                  樣本收集從2002年至2015年間,在倫敦哈默史密斯醫院國家肺動脈高壓服務中心就診的特發性或遺傳性多環芳烴患者,以及作為特發性和遺傳性肺動脈高壓國家隊列研究(臨床試驗)一部分從英國其他國家中心招募的患者。對照血漿樣本來自健康受試者和疾病對照受試者,后者是有癥狀的患者。見表1。

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                  表1 實驗樣本取樣研究設計表

                  實驗方法:采用超高效液相色譜-質譜聯用技術對血漿代謝物進行綜合研究,以確定早期死亡的高危人群,確定對治療反應良好的人群,為疾病的發病機制提供新的分子基礎。

                  統計分析及結果討論


                  為了防止異常值造成的結果偏差,對照組受試者和患者之間的初始組比較采用非參數U檢驗,以基于kolmogorov-smirnov檢驗的數據的最佳標準化為準,或者如果沒有符合p>0.05的檢驗,則進行排序。未檢測到代謝物的樣品用代謝物的最低檢測水平進行估算。

                  采用logistic回歸分析確定診斷組之間獨立區分的代謝物。采用正交偏最小二乘判別分析模型對這些代謝物進行了性能測試。R2分表示模型性能,Q2分基于交叉驗證評估重復性(受試者分為7組,在7項分析的基礎上預測其診斷)。用fisher精確試驗對代謝產物的鑒別和預后進行了途徑富集分析。

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                  圖1 分析流程圖

                  研究人員再次采用了兩組疾病對照受試者(n=70和69)的發現和驗證設計。代謝物的一個子集(53個代謝物中的20個)在校正潛在混雜因素后將多環芳烴患者與疾病對照者區分開來。異差代謝物包括嘌呤、多胺和TCA循環代謝物的增加和磷膽堿和鞘磷脂的減少(圖2A),通路網絡顯示中樞代謝物N2、N2dm2鳥苷和蘋果酸的重要性(圖2B)。

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                  圖2  區分肺動脈高壓患者和對照組的代謝物

                  在發現和驗證分析中,A和C圖顯示了健康對照組(HC)、多環芳烴患者、血管反應者和疾病對照組(DC)的個體模型分數。通過pah-hc(A)和pah-dc(C)比較的logistic回歸選擇代謝產物。B圖和D圖,為受試者工作特性曲線,顯示模型在區分多環芳烴與HC和DC受試者方面的性能。AUC表示曲線下面積;ci表示置信區間。

                  在兩個驗證分析中,該模型對健康受試者和多環芳烴患者進行了分類,準確率分別為89%和84%。此外,發現隊列中90%的多環芳烴血管應答者具有健康對照受試者典型的代謝物水平(圖3A和3B),在2個驗證分析中,該模型分別以69%和67%的準確率對疾病對照組和多環芳烴患者進行了分類(圖3C和3D)。

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                  圖3 基于低代謝物數量的判別分析區分患者組與對照組

                  在對于多環芳烴血漿代謝產物存活分析研究中,研究人員假設與疾病病理生物學最密切相關的代謝物將與臨床結果相關。為了確定與疾病進展和死亡率相關的代謝物,研究人員進行了生存分析。在發現和首次驗證的PAH組中,116例患者中有28例死亡,75例患者中有25例死亡,平均隨訪時間分別為3.3±1.0年和4.5±4.0年,如上圖所示。

                  第二個驗證隊列的患者隨訪時間不足以進行分析。在改變肌酐和利尿劑使用后,沒有其他潛在的混雜因素與生存率相關。在686種定量良好的代謝物中,640種符合Cox回歸分析的假設,其中62種在兩種分析中都考慮了肌酐和利尿劑的使用后是預后的。3年隨訪的受試者操作特征分析證實這些代謝物具有預后,并確定了最佳截止值。

                  為了確定獨立于當前預后的新途徑的代謝物,研究人員將62種預后代謝物與3種先前發現的最能預測患者生存率的標記物進行了比較,62種代謝物中有36種與這些測量結果無關。(圖4B)。

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                  4 與已確定的危險因素無關的預后代謝物

                  Venn圖(圖5)顯示了3個隊列中區分多環芳烴患者和健康對照組的代謝物與發現隊列和首次驗證隊列中多環芳烴患者和健康對照組之間的logistic回歸和預后代謝物之間的重疊。B圖,在發現分析中,健康對照組(HC n=58)、多環芳烴幸存者(n=110,樣本后3年存活)和非幸存者(n=24)之間顯示了來自圖A的19個重疊代謝物的聚類。紅色表示多環芳烴患者與對照組相比代謝產物水平升高(藍色表示代謝水平降低)。* 表示可能的代謝物特性,但沒有經過驗證。

                  上述分析確定并驗證,,共有99種代謝產物在多環芳烴中具有鑒別或預后作用,代表25種代謝途徑。特別是6條途徑富含感興趣的代謝物的途徑,包括脂肪酸(?;鈮A)、多胺和核苷代謝等。這些代謝產物中有16種既能鑒別多環芳烴,又能預測預后,這些代謝產物和其他3種通過logistic回歸模型篩選出來的代謝產物能最好地區分多環芳烴患者和健康受試者,并聚集成確定的代謝途徑。(圖5)。

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                  圖5 肺動脈高壓(pah)患者19種鑒別和預后代謝物的層次聚類分析

                  研究人員又分析了86名患者的樣本,他們在第二個樣本后至少隨訪了1年,兩個樣本之間的代謝物水平變化如圖所示。存活者與非存活者的99種代謝物中27種的變化有顯著性差異(p<0.05)。受試者工作特性曲線也證實了這些關聯并確定了預測截止值(圖6)。

                  圖6A:受試者最后隨訪時代謝物水平和生存狀態變化的操作特征分析。

                  圖6B、D:最后隨訪時按生存狀態分組的患者個體代謝物水平的變化。

                  圖6C:kaplan-meier分析顯示根據n-乙?;淖兓纸M的肺動脈高壓患者隨時間的生存率-連續樣本之間的蛋氨酸水平。

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                  圖6 連續樣本分析

                  圖7表示修飾核苷升高與血漿血管生成素升高的關系,在核糖核酸酶血管生成素切割轉移核糖核酸酶后,修飾的核苷可在應激期間釋放到循環中。為了確定這一機制是否與多環芳烴有關,研究人員在年齡和性別匹配的健康對照受試者和多環芳烴患者的代表性子集中測量了血漿血管生成素的含量。分析發現多環芳烴患者血漿中的血管生成素水平升高,與N2,N2-二甲基鳥苷水平有關。

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                  結論


                  1、在本文的研究中,研究人員驗證了多環芳烴患者色氨酸代謝途徑的產物S14升高、色氨酸和酪氨酸增加的結果,但酪氨酸的變化與膽紅素水平升高和肝功能不全有關,色氨酸及其其他主要代謝物5-羥色胺的水平沒有明顯改變。

                  2、循環修飾核苷(N2,N2-二甲基鳥苷,N1-甲基肌苷),TCA循環中間產物(蘋果酸,延胡索酸),谷氨酸,脂肪酸?;〈?,和多胺代謝產物增加,類固醇,鞘磷脂和磷脂水平降低是多環芳烴患者區別于癥狀性多環芳烴的特征。無肺動脈高壓的患者,循環代謝物水平的改善與更好的預后相關,可用于監測多環芳烴治療的反應。

                  參考文獻:Plasma Metabolomics Implicates Modified Transfer RNAs and Altered Bioenergetics in the Outcomes of Pulmonary Arterial Hypertension.




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