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                  灰黃霉素誘導小鼠肝損傷的代謝組學研究

                  發布日期:2019.09.18

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                  灰黃霉素(GSF)在小鼠中引起肝卟啉癥,其原理是模擬了人類紅細胞生成原卟啉(EPP)相關的肝損傷。目前的研究使用代謝組學方法研究了GSF誘導的小鼠肝損傷的生化基礎。小鼠中的GSF處理導致肝臟中原卟啉IX(PPIX)、N-甲基PPIX、膽汁酸和谷胱甘肽(GSH)的顯著增加。

                  代謝組學分析揭示了GSF的生物活化途徑,其促進GSF-PPIX、GSF-GSH和GSF-脯氨酸加合物的形成。N-甲基PPIX強烈抑制鐵螯合酶,這是將PPIX轉化為血紅素的酶,并導致PPIX積累。肝臟中過多的PPIX導致膽管阻塞并擾亂膽汁酸的穩態,GSH在肝臟中的積累可能是由于Nrf2介導的GSH合成的上調??偟膩碚f,本研究提供了GSF誘導的肝損傷的生化基礎,可用于了解人類EPP相關肝損傷的病理生理學。下面就為大家詳細地分享這篇代謝組學文獻。

                  引言


                  灰黃霉素(GSF)在動物和人類中用于治療真菌感染。GSF會引起多個副作用,包括混亂、頭暈、惡心、腹瀉以及疲勞有關的副作用。GSF上調δ-氨基乙酰丙酸合酶(ALAS)的表達,從而導致小鼠患肝卟啉癥。ALAS是血紅素合成途徑中的限速酶,可增加卟啉的產生。此外,GSF處理鐵螯合酶(FECH)導致的功能缺陷,這是將原卟啉IX(PPIX)轉化為血紅素的酶,因此GSF在小鼠的治療中會出現肝損傷的現象。這種表型是類似于與紅細胞生成性原卟啉人類受試者(EPP)相關的肝損傷。因此,GSF通常用作工具藥來產生,用于調查EPP相關的肝損傷。

                  在小鼠GSF研究中,我們發現肝細胞損傷,膽汁淤積,膽管增生和肝硬化。此外,在用GSF治療的小鼠肝臟中觀察到氧化應激。全基因譜分析顯示GSF的基因改變可能與炎癥,纖維化和膽汁淤積有關。盡管如此,GSF誘導的肝損傷的生化基礎仍未得到充分研究。目前的研究使用代謝組學方法在小鼠中解決了這兩個問題:(1)GSF在肝臟代謝組中的改變; (2)GSF如何引起肝臟代謝組的變化。

                  材料及方法


                  實驗試劑

                  灰黃霉素(GSF)、原卟啉IX(PPIX)、N-甲基PPIX、β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、谷胱甘肽(GSH)和L-脯氨酸(PRL)購自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO) 。膽汁酸的化學標準品得自Steraloids,Inc。(Newport,RI)。用于超高效液相色譜和四極桿飛行時間質譜(UPLC-QTOFMS)分析的所有溶劑均為市售的最高級別。


                  實驗動物及處理

                  給FVB / NJ小鼠(雄性,8周齡)喂食2.5%GSF飲食(w / w)或對照飲食(每組n = 4)14天?;谙惹暗难芯?,顯示出肝損傷小鼠[選擇GSF治療的劑量和時間16,18 ]。在治療的最后一天,將小鼠分別圈養在代謝籠中以收集尿液和糞便。然后,處死所有小鼠并收獲肝組織。將一部分肝組織固定在4%甲醛磷酸鹽緩沖液中。將剩余的肝組織在液氮中快速冷凍并儲存在-80℃直至進一步分析。


                  生化和病理分析

                  進行生化分析以測量血清中的丙氨酸轉氨酶(ALT)和堿性磷酸酶(ALP)活性。對于病理分析,將固定的肝組織在連續濃度的醇和二甲苯中進行脫水,然后進行石蠟包埋。切割4微米切片的肝組織并用蘇木精和曙紅染色。


                  代謝物分析和樣品制備

                  20μl血清樣品用75μL的甲醇中,然后在15000rpm轉速渦旋30秒,并離心混合 10分鐘。再將肝臟樣品在水中均質化(在400μl水中的100mg組織),然后將200μL等分試樣的甲醇加入到100μL肝勻漿中。將混合物1分鐘渦旋兩次,并在15,000rpm轉速離心 20分鐘。尿液樣本通過50μL尿液與100μL乙腈混合,然后以15,000rpm轉速離心制備 10分鐘。糞便在水中均質化,然后將200微升的乙腈:甲醇(1:1,V / V)加入到所得到的200μL混合物中,然后在15000rpm轉速離心持續10分鐘。將上清液轉移到新的Eppendorf小瓶中進行第二次離心。將1微升上清液注射到UPLC-QTOFMS系統上進行代謝物分析。


                  GSF的體外代謝

                  孵育在1×磷酸鹽緩沖鹽水(PBS,pH7.4)中進行,其含有10μMAFF和0.1mg小鼠肝微粒體(XenoTech,LLC,Lenexa,KS),體積為190μL。孵育一式三份進行。在37℃溫育5分鐘后,通過加入10μL的20mM NADPH(終濃度1.0mM)引發反應,并在輕輕搖動下繼續40分鐘。GSH或PRL(終濃度5.0mM)用于捕獲反應性代謝物。溫育通過加入冰冷的200μL甲醇終止,然后渦旋30秒和在15,000rpm轉速離心克 10分鐘。將1微升上清液注射到UPLC-QTOFMS系統上進行代謝物分析。


                  UPLC-QTOFMS分析

                  代謝物的色譜分離在Acquity UPLC BEH C18柱(2.1×100mm,1.7μm; Waters Corporation,Milford,MA)上進行。流動相A(MPA)在水中為0.1%甲酸,流動相B(MPB)在乙腈中為0.1%甲酸。梯度從2%MPB開始并保持1分鐘,然后是12分鐘線性梯度至95%MPB,保持8分鐘,然后降低至2%MPB用于柱平衡。流動相的流速為0.5ml / min,柱溫保持在50℃。QTOFMS系統(Waters Corporation,Milford,MA)以高分辨率模式(分辨率~20,000)進行電噴霧電離。源和去溶劑化溫度分別設定在150℃和500℃。施加氮氣作為錐形氣體(50L / h)和去溶劑化氣體(800L / h)。氬氣用作碰撞氣體。毛細管和錐形電壓設定為0.8kV和40V。用甲酸鈉校準QTOFMS,并通過間歇注射鎖定質量的亮氨酸腦炎實時監測(m / z = 556.2771)。


                  數據分析

                  質譜由MassLynx 4.1(Waters Corporation,Milford,MA)以質心格式從m / z 50至1000獲得。通過下式生成包含樣品同一性,離子同一性(保留時間和m / z)和離子豐度的多變量數據矩陣。 deisotoping,反卷積,峰值對齊,識別和整合。然后將數據矩陣導出到SIMCA-P +(版本13,Umetrics,Kinnelon,NJ)并通過均值中心和Pareto縮放進行變換。進行主成分分析(PCA)以分析不同處理組之間的自然相互關系。進一步地進行正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)以最大化類別辨別。


                  統計分析


                  所有量化數據表示為平均值±SD。組間的統計學顯著性通過雙尾學生t檢驗確定。當P小于0.05的值被認為是統計學顯著(本代謝組學實驗由上海譜領生物科技有限公司完成)。

                  研究結果


                  GSF誘導的小鼠肝損傷

                  與對照組相比,GSF治療導致血清ALT和ALP水平顯著增加(圖1A和1B),表明混合的肝細胞 - 膽汁淤積性損傷。GSF治療也導致肝臟腫大,因為GSF組肝臟與體重比顯著增加(圖1C)。正如預期的那樣,在GSF處理后,PPIX在小鼠肝臟中顯著積累(圖1D)。通過組織學分析,我們觀察到膽汁栓塞以及用GSF治療的小鼠肝臟中的炎癥(圖1F),表明膽管阻塞。這些生化和病理改變小鼠類似于在GSF性肝損傷以往的研究。

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                  圖 1


                  GSF干擾小鼠的肝臟代謝組

                  PCA分析顯示對照組和GSF組之間肝臟代謝組的明顯差異(圖2A)。OPLS-DA分析顯示有助于該組分離的離子,包括膽汁酸,PPIX和GSH(圖2B)。膽汁酸也是用GSF治療的小鼠血清中排名最高的離子(圖2C)。此外,代謝組學分析鑒定了肝臟和血清樣品中的GSF代謝物。此外,在用GSF處理的小鼠的肝臟中觀察到N-甲基PPIX的積累??傮w而言,GSF處理導致肝臟中PPIX,N-甲基PPIX,膽汁酸和GSH的顯著增加(表1)。

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                  圖 2


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                  表 1


                  膽管阻塞和膽汁酸積聚

                  肝臟是膽汁酸合成和穩態。我們用GSF(經處理的小鼠的肝臟觀察到的膽汁酸顯著積累圖2B和圖3A)。我們接下來測試了肝臟中膽汁酸的積累是否是由于編碼參與膽汁酸穩態的酶和轉運蛋白的基因的調節。促進膽汁酸合成的酶包括膽固醇7ɑ羥化酶(Cyp7a1基因),8β羥化酶(CYP8B1)和固醇27羥化酶(CYP27A1)。GSF處理對Cyp7a1表達無影響,但下調Cyp8b1和Cyp27a1的表達(圖3B))。對于轉運蛋白,GSF治療對多藥耐藥相關蛋白2(Mrp2)的表達沒有影響,后者是泵出膽紅素的轉運蛋白。然而,我們觀察到膽汁鹽輸出泵(Bsep)的上調和Na + -?;悄懰猁}協同轉運多肽(Ntcp)的下調(圖4B),這兩種轉運蛋白分別參與膽汁酸的外排和攝取。Bsep的增加和Ntcp的減少被認為是對阻塞性膽汁淤積的適應性反應。我們觀察到用GSF治療的小鼠膽管阻塞(圖1F)。因此,我們得出結論,GSF介導的肝臟中膽汁酸的富集是由膽管阻塞引起的,而不是由膽汁酸合成引起的。這種機制得到以下事實的支持:在用GSF處理的小鼠的血清中觀察到顯著的膽汁酸積累(圖2C和圖3C),其中膽汁酸排泄途徑被阻斷。

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                  圖 3


                  圖片關鍵詞

                  圖 4


                  谷胱甘肽(GSSG)

                  GSH是主要的內源性抗氧細胞[保護對抗氧化應激 ]。我們預計在GSF治療的小鼠的肝臟GSH耗竭和GSSG積累,因為PPIX導致氧化應激。令人驚訝的是,GSH水平在GSF處理的小鼠的肝臟中沒有降低,但是顯著增加(圖4A)。此外,對照和GSF處理的小鼠之間的GSSG水平沒有顯著差異(圖4B)。我們進一步檢測了谷氨酸 - 半胱氨酸連接酶(Gcl)的表達,這是GSH生物合成中的限速酶。GSF處理后Gcl顯著上調(圖4C)。GCL,NADH醌氧化還原酶-1(NQO1)和血紅素加氧酶1(HMOX-1)是Nrf2的,調節抗氧化劑蛋白質[的表達的轉錄因子的靶基因]。我們發現GSF處理后Nqo1和Hmox-1的表達也顯著上調(圖4D和4E),表明Nrf2是由GSF誘導的肝損傷引發的。

                   在用GSF處理的小鼠的肝臟,血清,尿液和糞便中篩選GSF代謝物??偟膩碚f,22種代謝產物進行了鑒定,包括9組先前報道的代謝物和13種新穎代謝物(表2,圖5)。在這些GSF代謝物中,一種PPIX-綴合的(M17),一種GSH-綴合的(M18),三種半胱氨酸綴合的(M19-21)和一種PRL-綴合的(M22)代謝物是令人感興趣的,因為它們與GSF的途徑相關。生物活化(圖5)。

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                  圖 5


                  圖片關鍵詞

                  表 2


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                  圖 6

                  通過使用GSH或PRL作為捕獲試劑,我們在GSF與小鼠肝微粒體的孵育中概括了GSF-GSH和GSF-PRL加合物(圖6D和6E)。此外,我們證實GSF-GSH和GSF-PRL加合物的形成是NADPH依賴性的,表明這些GSF的生物活化途徑是由CYP450形成的。此外,我們發現用GSF處理的小鼠肝臟中的N-甲基PPIX增加了6.3倍(圖6F)。GSF-PPIX是前體?甲基PPIX,其可強烈抑制FECH并導致PPIX積累。


                  結論


                  目前的研究描述了GSF介導的小鼠肝臟代謝組的改變。我們觀察到GSF處理后小鼠肝臟中PPIX,N-甲基PPIX,膽汁酸和GSH的顯著積累。此外,我們使用代謝組學方法重建了小鼠的GSF代謝,并提供了GSF代謝的完整圖譜。我們的數據表明GSF誘導的肝損傷由GSF生物激活引發,其產生GSF-PPIX加合物和N-甲基PPIX。?甲基PPIX強烈抑制PPIX轉化為血紅素和導致累積PPIX。GSF的反應性代謝產物和高水平的PPIX可直接導致肝損傷。此外,肝臟中過量的PPIX導致膽管阻塞并擾亂異生素和內生素(如膽汁酸)的體內平衡,這反過來又可加強GSF介導的肝損傷(圖7)。

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                  總的來說,本研究提供了GSF誘導的小鼠肝損傷的代謝組學觀點。研究數據表明,由于PPIX介導的膽管阻塞,GSF的肝毒性可能由GSF的活性代謝物,PPIX的積累和在肝臟中積累的內生素引起。


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