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                  案例分享

                  通過代謝組學技術了解芽孢桿菌B006表面素的產生機制

                  發布日期:2019.09.29

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                  近年來,代謝組學的研究變得如火如荼,但是到底如何應用代謝組學技術來為自己的科研服務呢?今天小編為大家分享一篇關于“代謝組學技術在發酵方面的應用”的文章。

                  摘要

                  芽孢桿菌B006可通過有效定植和產生表面素發揮生物防治劑的作用,為了揭示表面素的產生機理,采用氣相色譜-質譜聯用非靶向代謝組學方法,對工業培養基M3和M4中生長的B006菌株進行了代謝產物比較,探索與表面素生物合成相關的候選代謝物。有助于了解菌株B006的代謝機制及其工業上表面素生產的發酵優化。

                  前言


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                  芽孢桿菌抑制土傳植物病原菌的兩個重要機制是根際定植和脂肽的產生。表面素是根際和植株中檢測到的三種最重要的脂肽之一,并由7個氨基酸(l-亮氨酸-d-亮氨酸-l-天冬氨酸-l-纈氨酸-d-亮氨酸-l-亮氨酸-l-谷氨酸)與12-16碳脂肪酸的羧基和羥基結合而成,表面素具有較強的生物表面活性,具有較強的抑制植物病害的能力,對人體和環境具有較低的毒性,因此得到了廣泛的研究。與其他通過靶向蛋白質合成或DNA復制來抑制真菌生長的殺菌劑不同,表面素通過物理化學作用通過細胞膜破壞或解體來抑制細菌生長或通過促進有益菌的定植和誘導全身抗性來抑制真菌,然而,表面活性劑生產成本高,限制了其在農業上的商業應用。

                  之前有研究表明,工業培養基M3有利于菌株B006的孢子形成,而培養基M4有利于表面活性劑生產,這些培養基如何影響菌株B006的代謝是一個非常有趣的問題。本研究采用氣相色譜-質譜聯用技術進行非靶向代謝組學研究芽孢桿菌B006菌株表面素產生的機制,系統的揭示潛在的關鍵代謝產物及其相關的生物途徑,并提出了可能的代謝途徑。

                  材料與方法

                  B006菌株培養

                  將芽孢桿菌B006分別在M3和M4培養基中進行培養,其中M3培養基包含17.5 g /l玉米淀粉,5.25 g /l蔗糖,14.0 g /l豆餅粉,5.25g /l CaCO3,M4培養基包含10.0 g /l牛肉提取物,15.0 g /l玉米粉,3.0 g /lNaNO3和3.0 g /l氯化鈉,芽孢桿菌B006培養56h,從8h開始每隔4h取1ml發酵液,在顯微鏡下計數細菌細胞數量和產孢率,采用油分散法測定表面素產量,采用高效液相色譜-電噴霧串聯反應法測定了表面活性劑的最終收率,過與標準表面活性劑的保留時間和質譜比較,利用MassLynx軟件計算色譜圖中相對峰面積,確定了表面活性劑的總量和組成。

                  GC-MS的樣品制備

                   培養B006菌株16h后,每個樣本取20 mL菌液,每組7個生物學重復,放入50 mL離心管中。將離心管放置在液氮中1秒,然后立即搖動試管以避免冷凍。重復此過程10次,等試管冷卻至9℃,3380g離心2 min,0.9%NaCl洗滌三次,液氮冷凍,- 80℃保存至使用。

                  GC-MS

                  采用美國安捷倫公司的氣相色譜質譜聯用儀(型號7890A/5975C)和德國MACHEREY-NAGEL公司 OPTIMA? 5 MS Accent熔融硅毛細管色譜柱(30 m × 0.25 mm × 0.25μm)對衍生的酸奶樣本進行代謝組學檢測分析。載氣為高純(純度大于99.999%)氦氣,流速1毫升/分鐘。采用梯度升溫程序對樣本進行分離分析。梯度升溫程序為:起始爐溫為70℃并維持2分鐘,以6℃/分鐘升到160℃,繼續以10℃/分鐘升到240℃,以20℃/分鐘升到300℃并維持6分鐘。以無分流模式進樣1微升,溶劑延遲時間設定為6分鐘。進樣口、傳輸線和電子碰撞(EI)電離源溫度分別設定為250℃、260℃和230℃。EI能量設定為70電子伏。采用全掃描方式對質荷比(m/z)范圍為50-600的數據進行采集。(此代謝組學實驗由本公司負責完成)。

                  數據處理

                  參照文獻方法(Gao et al. 2010)對GC-MS原始數據進行峰提取、峰對齊、反卷積分析和進一步處理,最終數據輸出為包含觀察量(樣本名)、變量(保留時間-質荷比)和積分面積的excel數據文件。然后在excel軟件中對峰面積數據進行面積百分比歸一化處理。為了消除樣本制備和GC-MS分析造成的系統變異,采用質量控制(QC)樣本對數據進行校正。

                  PCAOPLS-DA分析

                  根據細胞提取物的色譜分析表明,不同培養基對細胞內代謝物的組成和豐度有顯著影響 如圖1所示;

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                  通過PCA得分圖(Scores plot)如圖2所示。PCA得分圖顯示M3組和M4組之間有分離,因此PCA得分圖揭示CKK25-1組兩組樣本之間有代謝差異, 結果表明,B006菌株在M3M4培養基中生長產生不同的代謝產物。

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                  結果與討論


                  B006菌株的生理特性

                  在培養基M3和M4中分別生長16 h后,如圖3(a、b)中 B006細胞密度相似,然而,M3培養基中一些細胞開始形成內生孢子(紅色箭頭所示),而M4培養基中確沒有,結果表明,不同培養基組成對B006菌株的生理特性有明顯影響。

                  采用油分散法對生長在不同培養基中的菌株B006的表面素產生的能力進行了初步評價,如圖1c所示,在兩種培養液中孵育16 h后,油的分散直徑均呈增加趨勢,但在孵育40 h后均呈下降趨勢,因此在16 h時采集樣品進行代謝組學分析。與M3培養基相比,M4培養基更有利于表面素的產生,在24-56 h的時間內,M4培養基的表面活性劑產量為M3培養基的2倍以上。

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                   細胞內差異代謝物的鑒定

                  將色譜保留時間和質譜比對數據庫,共篩選并定性出78個差異性物質,在M4組觀察到的44個代謝物上調,包括14個氨基酸(谷氨酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、酪氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸和纈氨酸)及其衍生物,四種核苷酸(腺嘌呤、肌苷、鳥苷和黃嘌呤) 兩種有機酸(延胡索酸和琥珀酸)和1,3-二羥基丙酮,可能與表面素的產生密切相關; 相比之下,M3組中有7種代謝物是上調的,并可能是促進了菌株B006的內生孢子的形成。詳見表1。

                  圖片關鍵詞表1.docx

                   代謝通路分析

                   通過圖4可以看出,在差異代謝途徑中,氨基酸代謝途徑和氨?;?tRNA合成途徑對表面素的合成有顯著性影響,眾所周知,氨?;?tRNA負責將氨基酸運輸到核糖體用于合成肽鏈,與氨基酸的生物合成有重大關聯,因此,它在M4組中的上調是提高表面素含量的關鍵因素,在以往的研究中,表面素的三種結構氨基酸(亮氨酸、纈氨酸和異亮氨酸)和三種非結構氨基酸(賴氨酸、蘇氨酸和絲氨酸)可作為表面素結構氨基酸的前體或中間體的來提高表面素的產量。

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                  在這項研究中,除了上述氨基酸外,其他九個氨基酸(谷氨酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸)和衍生物在M4組都是上調的,可能與表面素合成密切相關。進一步通路分析提示天門冬氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、4-羥脯氨酸可能作為表面素結構氨基酸的前體或中間體,從而提高表面蛋白的產量。

                   TCA循環中延胡索酸和琥珀酸表達上調,可能通過丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝促進表面素的生成。

                  小結


                  綜上所述,這篇文章用代謝組學的方法研究了芽孢桿菌B006在兩種工業培養基中產生表面素的代謝機制。研究發現,丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸、甘氨酸/絲氨酸/蘇氨酸、精氨酸/脯氨酸和谷胱甘肽的代謝,以及纈氨酸/亮氨酸/異亮氨酸的生物合成與表面素的產生密切相關,這些氨基酸及其衍生物可能作為表面素結構氨基酸的前體或中間體。在TCA循環中,琥珀酸與表面素的產生也有密切聯系。該研究首次揭示了B006菌株表面素合成的代謝途徑,并探索了與表面素生物合成密切相關的候選代謝物。有助于了解菌株B006的代謝機制及其工業上表面素生產的發酵優化。

                  通過學習這篇文章,我們發現原來代謝組學不僅僅是可以為科研領域服務,工業生產領域竟然也可以用到這門技術。

                   文獻出處:Insight into the surfactin production of Bacillus velezensis B006 through metabolomics analysis. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology (2018) 45:1033–1044,

                  https://doi.org/10.1007/s10295-018-2076-7

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