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                  案例分享

                  原來普洱茶還有這些作用!

                  發布日期:2019.08.22

                  寒冷的冬日,很多人喜歡手中捧一杯有益于健康的普洱茶慢慢品嘗。普洱茶有抗氧化活性,有助于降低人體代謝物中的肌酐,從而可起到保護腎臟的作用。在飲用普洱茶后、人體內5-羥色氨酸(一種神經藥物的中間體)水平升高,因而飲用普洱茶有助于預防頭痛,減輕體重,緩解壓力和失眠。普洱茶的一種特征成分茶褐素(TB)具有抗癌活性和調節血脂和降低膽固醇的功能;另一種特征成分沒食子酸(GA)可降低人體血糖和血脂,并抑制HepG2細胞合成膽固醇。

                  普洱茶根據發酵工藝不同分為生茶和熟茶兩種,生茶由曬青茶精制而成,熟茶則需經過渥堆、發酵的過程,并且一般認為普洱茶存放時間越長,茶的色澤味越好,生物活性作用也越強。讓小編帶大家來分享一篇經典的使用綠茶、紅茶、普洱茶作為研究對象的代謝組學技術方面的文獻。


                  摘要:茶葉加工的工藝差異導致茶葉(沏泡液)化學成分和茶葉沏泡液的顏色不同。此項研究使用化學分析方法分析和比較普洱茶(含不同年齡的普洱茶)、紅茶、綠茶的化學成分差異。此研究還通過利用超高效液相色譜 - 四極桿飛行時間質譜(UPLC-QTOFMS)并結合多變量統計技術研究了人體對普洱茶攝入的生物反應。 普洱茶攝入期間和之后的代謝改變的特征表現在尿液中5-羥色氨酸,肌醇和4-甲氧基苯乙酸的濃度升高,以及3-氯酪氨酸和肌酸酐的濃度的降低。 本研究突出表現了運用代謝組學技術評估營養干預的潛力,利用代謝組學研究普洱茶的代謝是邁向全面理解普洱茶對人體新陳代謝影響的重要一步。

                  前言:

                  茶(Camellia sinensis L.)是一種具有4000年歷史的天然藥物,現在它已成為世界上最受歡迎的飲料之一。  茶葉因具有誘人的香氣,味道和通常被人們認為有益于健康而廣受歡迎,并成為人們的理想的餐后飲料。

                  根據發酵程度,茶一般可分為三大類:未發酵的綠茶,部分發酵的烏龍茶和包種茶,以及完全發酵的黑茶和普洱茶。綠茶和烏龍茶主要在亞洲和北非為人們所飲用,而紅茶的飲用范圍遍及全世界。主產自中國云南省的普洱茶主要在亞洲,特別是在中國西南部,為人們所大量飲用。紅茶和普洱茶都屬于發酵茶; 然而,有研究報道像黑曲霉這樣的微生物只在普洱茶發酵過程中被發現。普洱茶發酵過程中微生物氧化作用,比紅茶發酵過程中的酶促氧化作用更徹底的將茶多酚氧化,這導致了導致普洱茶中茶多酚和兒茶素的濃度較低。

                  干燥的普洱茶成品通常被壓成餅狀或磚塊狀,以適合長期儲存。此外,人們通常認為普洱茶的質量隨著普洱茶年齡的增長而提高,而與普洱茶相對照的是,綠茶則是未發酵的茶,并且綠茶盡可能在新鮮時飲用更好。許多研究表明,普洱茶具有廣泛的生物和藥物特性,有研究分別報道了普洱茶的以下的活性:對于大鼠的降膽固醇作用;自由基清除作用;肺炎克雷伯菌支原體(Mycoplasma pneumoniae和口腔支原體(Mycoplasma orale的滅微生物活性;對百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis的殺菌活性;抗肥胖,抗突變和抗菌活性;降低大鼠血漿中大鼠血漿甘油三酯活性,降低大鼠中總膽固醇和降低低密度脂蛋白(LDL-cholesterol)膽固醇的作用;和防止低密度脂蛋白(LDL)氧化的作用。

                  據報道,利用不同的技術生產的不同種類的茶以及不同年齡的普洱茶的化學成分和藥效都不同。在這項研究中我們試圖區分各種茶的化學成分差異,確定各種年齡段普洱茶的質量的差異,并確定人類攝入普洱茶時通常的代謝反應。為此,我們應用了基于UPLC-QTOFMS技術的代謝組學方法。普洱茶的萃取液和人在攝入普洱茶后的體液樣品的質譜檢測圖包含了極其豐富的組分信息,可以用來快速進行多種代謝物評估。為了分析UPLC-QTOFMS技術檢測中生成的大量數據、并評估普洱茶攝入時各因素對體液代謝物數據的影響,需要運用精良最先進的計算機軟件工具進行多變量統計分析,以探究人體對于普洱茶飲用生物反應,及其中涉及的代謝網絡的完的整性,代謝系統的多樣性、個體代謝反應的復雜性。有研究者使用基于核磁共振技術(NMR)和基于氣質聯用技術(GC-MS)的代謝組學成功地進行了綠茶的質量評估,并評估了飲用紅茶、綠茶和洋甘菊對人體代謝的影響。在這項研究中,我們調查了綠茶、紅茶、普洱茶之間的成分的差異,以及不同年齡的普洱茶的質量的差異;還運用UPLC-QTOFMS和結合多變量統計分析的代謝組學策略,分析了人體在6周時間內對普洱茶攝入的代謝反應。

                  材料和方法

                  化學品和材料 亮氨酸 - 腦啡肽,甲酸,茶氨酸,精氨酸和表兒茶素購Sigma-AldrichSt.Louis,MO)。 HPLC級的乙腈和甲醇購自Merck(德國)獲得。分析級甲醇購自上海林楓化學試劑有限公司(中國)。所有水溶液均用Milli-Q系統(18.2MΩ,Milipore,Bedford,MA)生產的超純水制備。楊梅素和茶黃素購自JK 化學品有限公司(中國上海)。兒茶素,表沒食子兒茶素(EGC),表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG),表兒茶素沒食子酸酯(ECG),沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG)和肌醇購自上海順博生物工程有限公司(中國上海)。槲皮素,山奈酚,綠原酸和沒食子酸購自國家藥物和生物制品研究所(中國北京)。

                  有試驗所采用的普洱茶,紅茶和綠茶的信息,請參閱支持信息。正品普洱茶具有以下四個特點。它必須在云南省種植,尤其以在思茅區或西雙版納州種植的為好。必須使用屬于野茶樹(camellia sinensis)大葉茶樹種的新鮮葉子作為原料,并且必須經過后發酵工藝處理以產生普洱茶獨特的形狀和固有特征。本研究之中使用的普洱茶的質量,經評估符合中國云南省茶葉地方標準DB53 / T103-2006的要求。

                  用于UPLC-QTOFMS分析的茶樣品制備。將干燥的茶葉研磨成細粉并使用20目的篩網過濾。稱量約約0.1g細茶粉(~0.1g)并標準化,并加入70%(v / v)甲醇(3mL)。然后將此茶粉末在60℃的超聲波水浴中萃取60分鐘。萃取的過程重復兩次。冷卻后,將溶液以13,000rpm離心15分鐘,并將所得上清液立即儲存在-80℃,直到UPLC-QTOFMS分析前。將超純水(500μL)加入茶提取物(500μL)中并渦旋震蕩1分鐘,然后使用針頭式濾器(0.22μm)過濾上清液以用于UPLC-QTOFMS分析。

                  茶色素的分析。茶色素的成分是復雜的成組的多種化合物,難以分離成單一化合物。因此,本研究采用文獻中報道的系統方法進行主要茶色素的分析,分析的茶色素的種類包括:茶褐素(theabrownin /TB),茶黃素(theaflavin/TF)和茶紅玉素(thearubigin/TR),并使用紫外 - 可見分光光度計(型號:UNIC UV-2102 PCS,UNIC,USA)進行定性和定量的測定。

                  實驗的受試者與實驗設計。將約5kg5年的普洱茶混合使樣品均質化,然后將樣品研磨成細粉并使用20目篩網過濾。使用200ml沸水沏泡通10g普洱茶粉末得到普洱茶液,并將茶液需過濾。實驗的參與受試者每天飲用相當于5杯茶液的劑量。參與此研究的受試者的平均年齡為25歲(年齡的范圍22-32歲),包括了的10名健康男性(n=10)和10名健康男性女性(n=10),共20人,每個受試者簽署了書面的同意。

                  每天上午11:0011:30期間請受試者現場采集尿液樣本,受試者參與實驗的時間是為期6周,包括2周基線期,2周每日普洱茶攝取階段和2后期階段。在普洱茶攝取階段,受試者在大約在每天的上午10點飲用200mL普洱茶。受試者飲用普洱茶后沒有副作用。在實驗期間受試者進食標準飲食,提以避免飲食對普洱茶的代謝結果的潛在影響。同時記錄受試者的進食量和體重。

                  尿液樣品制備。將收集的尿液樣品在4℃以13,000rpm離心10分鐘,并將所得上清液立即儲存在-80℃。將超純水(500μL)加入尿液樣品(500μL)中并渦旋震蕩1分鐘,然后使用針頭式濾器(0.22μm)過濾,處理后的樣品用于UPLC-QTOFMS分析。

                  UPLC-QTOFMS分析。使用Waters ACQUITY 超高壓液相色譜分析(UPLC)系統進行茶液成分的和尿液代謝物的分析,該系統配備有雙相的流動相輸送系統和樣品進樣的系統(Waters Corporation,Milford,MA),色譜系統后面偶聯與配備有電噴霧接口(Waters Corporation, Milford, MA)Micromass Q-TOF Premier質譜儀相。色譜分離采用2.1×100mm1.7μm ACQUITY BEH C18色譜柱。色譜柱的運行時的分離條件:45℃,流動相為1-99%乙腈(0.1%(v / v)甲酸) - 甲酸水溶液(0.1%(v / v)甲酸),以0.40 mL / min的流動速率梯度洗脫10分鐘,。上樣量5μL。依照之前我們文獻中報道的優化條件選擇質譜分析準確度和詳細的質譜參數。在代謝物分析實驗期間,對于每個樣品,從501000Da獲得質心數據,掃描時間為0.10秒,并且在10分鐘的分析時間內具有0.01秒的掃描間延遲。

                  數據處理和統計分析。 分析尿樣的質譜(UPLC-QTOFMS)數據以識別潛在的差異代謝物。 在使用MarkerLynx版本4.1Waters,Manchester,U.K。)的軟件分析電噴霧質譜(ES +)原始數據時,使用我們之前的工作中報到的參數。 對于每一個樣品的多峰值強度排列表,使用保留時間(RT)和核質比(m / z)數據對作為每個峰的標識符。得到的三維矩陣包含樣品名稱(觀察值)、任意峰的(保留時間-核質比m / z對),和峰值強度信息等多個數據參數,將此信息導入到SIMCA-P軟件11.0Umetrics,Umea?,Sweden),以進行于多變量統計分析。 使用先前報道的方法進行基于質譜(UPLC-QTOFMS)分析的多變量統計分析。

                  結果和討論:

                  茶葉樣品的成份分析。用我們先前研究中報道的代謝組學分析方法,我們用UPLC-QTOFMS結合多變量統計分析方法分析了普洱茶,紅茶和綠茶的成份。圖1A Figure 1A呈現的是普洱茶,紅茶和綠茶的UPLC-QTOFMS基峰強度色譜圖(base peak intensity chromatograms,BPI)。通過直觀的目測這個UPLC-QTOFMS色譜圖(Figure 1A發現,各樣品之間的差異不明顯。然而,通過應用多變量統計分析, 得到了圖1B(Figure 1B)的正交偏最小二乘方方判別分析圖(OPLS-DA),圖中三種類型茶葉的數據呈現明顯的分離。在圖1B(Figure 1B)的正交偏最小二乘方判別分析(OPLS-DA)圖中,三類茶葉的數據所處的區域分離良好,這表明綠茶、普洱茶、紅茶和綠茶在化學成分上有差異。

                  代謝組學-脂質-代謝流-靶向定量

                  Figure 1. Comparison of UPLC-QTOFMS base peak intensity (BPI) chromatograms (A) and scores plot (t[1] vs t[2]) generated from OPLS-DA of UPLC-QTOFMS spectra of pu-erh teas (), black teas (), and green teas () (B).

                  紅茶、綠茶和普洱茶這三種茶的化學成分不同(參見支持信息表S2)。表1、表2總結了三種茶葉成份的差異,其中包含了多種茶色素類物質(如茶黃素)、多種兒茶酚(catechin)類物質(如表沒食子兒茶素沒食子酸酯)的濃度差異。圖2和圖3則揭示:三種茶葉的主要茶色素-茶褐素(TB)、茶黃素(TF)和茶紅玉素的含量(TR)顯著不同,并且三種茶葉的多種兒茶酚類物質的含量也明顯的不同。此外,本研究還分別比較了普洱茶-紅茶, 普洱茶-綠茶,以及紅茶-綠茶的這三組茶葉的化學成分的差異,比較的項目涉及了堪非醇和兒茶酚類物質(詳見支持信息中的圖S1-S3、表S3-S5)。研究發現綠茶中的特征成分是茶多酚類物質和茶氨酸,紅茶的特征成分是茶黃素(TF)和茶紅玉素(TR),普洱茶的特征成分是茶褐素(TB)和沒食子酸(GA)(圖2)。在普洱茶發酵過程中,兒茶酚含量逐漸減少,因此在普洱茶中兒茶酚含量比紅茶和綠茶中都低。伴隨著普洱茶的發酵, 表沒食子兒茶素(epigallocatechin, EGC),表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate ,EGCG)表兒茶酸(epicatechin, EC)等些兒茶酚類物質在普洱茶中幾乎檢測不到(圖3)。隨著發酵的進行,茶多酚類物質、兒茶酚類物質,茶黃素(TF),茶紅玉素(TR),氨基酸類物質和可溶性糖的含量大幅度的減少,然而,茶褐素(TB)含量卻增加了。與紅茶相比,普洱茶幾乎不含茶黃素(TF)或茶黃酸(TFA)等使茶葉具有澀味和苦味的物質。

                  Table 1. The Contents of Tea Pigments in Different Teas

                  sample no.

                  type

                  preservation period (yr)

                  TF (%)

                  TR (%)

                  TB (%)

                  1

                  pu-erh tea

                  1

                  0.29

                  0.36

                  8.33

                  2

                  pu-erh tea

                  3

                  0.23

                  0.99

                  8.75

                  3

                  pu-erh tea

                  5

                  0.22

                  0.76

                  8.95

                  4

                  pu-erh tea

                  8

                  0.21

                  0.75

                  9.29

                  5

                  pu-erh tea

                       10

                  0.25

                  0.73

                  10.72

                  6

                  pu-erh tea

                  1

                  0.20

                  0.76

                  11.92

                  7

                  pu-erh tea

                  5

                  0.19

                  0.47

                  9.82

                  8

                  pu-erh tea

                  1

                  0.21

                  0.83

                  8.91

                  9

                  pu-erh tea

                  2

                  0.21

                  0.43

                  11.25

                  10

                  pu-erh tea

                  5

                  0.23

                  0.27

                  8.88

                  11

                  pu-erh tea

                  8

                  0.19

                  -a

                  13.65

                  12

                  pu-erh tea

                  10

                  0.16

                  -a

                  11.30

                  13

                  black tea

                  1

                  0.37

                  8.84

                  6.66

                  14

                  black tea

                  1

                  1.11

                  10.00

                  8.56

                  15

                  black tea

                  1

                  0.47

                  8.33

                  7.19

                  16

                  black tea

                  1

                  0.31

                  8.20

                  7.29

                  17

                  green tea

                  0.5

                  0.14

                  4.90

                  3.26

                  18

                  green tea

                  1

                  0.16

                  4.36

                  2.78

                  19

                  green tea

                  1

                  0.23

                  5.49

                  5.49

                  20

                  green tea

                  1

                  0.22

                  5.03

                  2.67

                  21

                  green tea

                  1

                  0.21

                  4.67

                  2.87

                  22

                  green tea

                  1

                  0.19

                  5.32

                  3.50

                  23

                  green tea

                  0.5

                  0.18

                  3.28

                  2.17

                   24green tea           0.50.12 3.132.12

                  a Not detected


                  Table 2. The Contents of Determined Constituents in Different Teas (μg/mL)

                  sample no.

                  type

                  preservation period (yr)

                  TFA

                  C

                  CG

                  GCG

                  EGC

                  EC

                  ECG

                  quercetin

                  1

                  pu-erh tea

                  1

                  0.75

                  -a

                  -

                  8.29

                  1.82

                  9.06

                  9.89

                  1.14

                  2

                  pu-erh tea

                  3

                  1.11

                  0.25

                  -

                  10.80

                  3.79

                  21.13

                  10.66

                  1.22

                  3

                  pu-erh tea

                  5

                  4.34

                  1.35

                  -

                  8.29

                  4.98

                  44.36

                  18.21

                  1.30

                  4

                  pu-erh tea

                  8

                  4.16

                  1.32

                  -

                  8.85

                  5.17

                  40.26

                  11.35

                  1.18

                  5

                  pu-erh tea

                  10

                  4.05

                  1.31

                  -

                  8.29

                  5.62

                  35.88

                  8.19

                  1.16

                  6

                  pu-erh tea

                  1

                  35.65

                  10.86

                  207.48

                  163.00

                  70.24

                  114.41

                  537.14

                  3.93

                  7

                  pu-erh tea

                  5

                  28.34

                  4.82

                  180.96

                  90.50

                  34.01

                  75.04

                  471.65

                  5.94

                  8

                  pu-erh tea

                  1

                  0.39

                  -

                  -

                  8.29

                  1.26

                  -

                  8.19

                  0.94

                  9

                  pu-erh tea

                  2

                  0.25

                  -

                  -

                  8.29

                  1.26

                  2.51

                  8.19

                  0.99

                  10

                  pu-erh tea

                  5

                  0.70

                  -

                  -

                  8.29

                  1.56

                  6.30

                  8.19

                  0.98

                  11

                  pu-erh tea

                  8

                  0.23

                  -

                  -

                  8.16

                  1.33

                  6.02

                  8.02

                  0.91

                  12

                  pu-erh tea

                  10

                  0.23

                  -

                  -

                  8.23

                  1.26

                  5.68

                  7.87

                  0.89

                  13

                  black tea

                  1

                  21.94

                  0.70

                  37.06

                  57.60

                  10.57

                  36.50

                  116.20

                  5.82

                  14

                  black tea

                  1

                  33.12

                  0.36

                  19.02

                  23.10

                  6.86

                  15.85

                  71.64

                  0.84

                  15

                  black tea

                  1

                  34.73

                  -

                  -

                  13.00

                  2.10

                  0.16

                  11.32

                  0.84

                  16

                  black tea

                  1

                  30.50

                  -

                  1.60

                  19.30

                  3.18

                  6.62

                  28.63

                  0.84

                  17

                  green tea

                  0.5

                  43.58

                  3.32

                  174.16

                  315.00

                  47.23

                  85.65

                  454.84

                  2.73

                  18

                  green tea

                  1

                  29.19

                  1.61

                  81.55

                  238.00

                  97.10

                  72.33

                  226.11

                  1.93

                  19

                  green tea

                  1

                  24.71

                  2.62

                  154.41

                  338.00

                  95.44

                  55.21

                  406.06

                  4.72

                  20

                  green tea

                  1

                  39.25

                  5.58

                  236.62

                  298.00

                  91.86

                  114.78

                  609.12

                  4.81

                  21

                  green tea

                  1

                  37.87

                  6.40

                  255.32

                  350.00

                  122.19

                  97.21

                  655.30

                  7.65

                  22

                  green tea

                  1

                  44.31

                  3.60

                  116.64

                  225.00

                  127.12

                  87.10

                  312.77

                  4.70

                  23

                  green tea

                  0.5

                  44.24

                  3.10

                  123.62

                  337.00

                  157.21

                  95.55

                  330.01

                  2.36

                       24green tea            0.547.803.89168.57269.00 58.1474.69441.032.72

                  a Not detected

                  茶色素具有某些類似藥物的特性,例如茶色素具有抗癌活性和調節血脂和降低膽固醇的功能。普洱茶發酵過程中茶褐素(TB)的增加使普洱茶具有的棕色,但對于茶褐素的類似于藥物作用的機制迄今為止還沒有得到闡明。沒食子酸(GA)是普洱茶發酵過程中表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)降解的主要產物之一,是普洱茶的另一種活性成分。據報道,沒食子酸(GA)可降低人體血糖和血脂,并抑制HepG2細胞合成膽固醇。我所發現的在普洱茶中表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)含量降低和沒食子酸(GA)含量增加與先前的研究的結果一致。普洱茶發酵過程使沒食子酸(GA)含量增加,此發現可以解釋普洱茶的降膽固醇作用。

                  代謝組學-脂質-代謝流-靶向定量

                  Figure 2. The contents of tea pigments in pu-erh teas (◆), black teas (●), and green teas (△). 


                  代謝組學-脂質-代謝流-靶向定量

                   Figure 3. The contents of TFA, C, CG, GCG, EGC, EC, ECG, and quercetin in pu-erh teas, black teas, and green teas.   


                  代謝組學-脂質-代謝流-靶向定量

                  Figure 4. PLS-DA scores plot of pu-erh tea of different ages: 1-, 3, 5-, 8-, and 10-year-old.

                  如上所述,據報道較長時間的老化改善了普洱茶的質量。因此,我們收集了不同年齡的普洱茶,使用UPLC-QTOFMS結合多元統計分析方法,并運用我們以前研究所采用的預處理方法,檢測和分析了不同年齡的普洱茶。 UPLC-QTOFMS檢測得到的數據進行雙組分偏最小二乘方分析(PLS),圖4Figure 4)的偏最小二乘方分析(PLS)得分圖描繪了不同的年齡的普洱茶成分的一般化學變化。表3 Table 3 中則列出了導致不同年齡普洱茶數據分離的差異化學物質。圖5 Figure 5. 中詳細比較了1年和10年的普洱茶的差別。僅僅憑目測直接觀察不同年齡普洱茶樣品的UPLC-TOFMS 基峰信號強度色譜圖(BPI) ,不能發現明顯的數據信息的差異(BPI圖沒有在文中呈現)。而采用偏最小二乘方分析法(PLS)分析數據,可看到在圖4PLS得分圖,通過PC1參數項可容易地判定不同年齡的普洱茶數據分離。從圖4還可以看出,1歲和3歲的普洱茶樣品的某些化學成分濃度不同,并且兩種普洱茶中這些化學成分的濃度與5歲,8歲和10歲的普洱茶也不同。 5歲,8歲和10歲的普洱茶的數據有分離但數據的分離較不明顯,這可能表明,雖然普洱茶的化學成分組成(和質量)隨時間而變化,但一定時間后逐漸趨于穩定。因此,此研究選擇了5歲普洱茶用于研究人飲用普洱茶的生物學反應。

                  Table 3. Summary of the Differential Metabolites from VIP Values of Two Component PLS-DA Model (R2Y ) 0.982, Q2Y ) 0.946) of Pu-erh Tea

                  (10 Year)a

                  metabolite identification

                  VIP

                  glucose

                  (5)

                  caffeine

                  (1)

                  kaempferol

                  (2)

                  gallocatechin

                  (4)

                  catechin

                  (3)

                  epicatechin

                  (7)

                  arginine

                  (6)

                                      theanine(8) 

                  a Compared to the pu-erh tea (1 year), represents significantly elevated concentration, whereas represents significantly lowered concentration.


                   

                  代謝組學-脂質-代謝流-靶向定量

                  Figure 5. Metabolic profiles depicted by PLS-DA scores plot of UPLC-QTOFMS spectra between samples of pu-erh tea (1 year) and pu-erh tea (10 year). 


                  代謝組學-脂質-代謝流-靶向定量

                  Figure 6. Comparison of UPLC-QTOFMS base peak intensity (BPI) chromatograms of urine collected during the predose phase (A), pu-erh tea intake phase (B), and postdose phase (C).

                  尿液樣品制備的優化。 UPLC-QTOFMS技術分析之前,參照Plumb等人的方法,使用超純水或0.1%甲酸(v / v)水溶液稀釋尿液樣品。 詳細的實驗參數在支持信息有呈現。 在支持信息中還呈現了不同的稀釋體積對代謝物分析結果的影響,伴隨的UPLC-QTOFMS基峰信號強度色譜圖(BPI)一并呈現在支持信息中。 通過檢查基峰信號強度色譜圖(BPI)發現,在條件S1下,在保留時間為3.79分鐘時,峰值是飽和的。在條件S3下,在保留時間為79分鐘之有多峰值信號。 還研究了分別用水和0.1%甲酸溶液稀釋樣品,對樣品檢測峰信號的影響,但發現稀釋樣品對樣品峰信號分離的改善不大。 因此,最終采用兩倍體積的水稀釋尿液樣品。 

                  尿液UPLC-QTOFMS圖譜的分析。 如圖6所示(Figure 6. ),僅通過目測檢查普洱茶攝入之前,期間和之后從男性參與者的尿液的UPLC-QTOFMS基峰信號強度色譜圖(BPI)難以發現明顯的數據差異,盡管各樣品BPI圖譜中某些峰強度有差異。我們隨后使用了統計學分析方法,以明確的解析普洱茶攝入前后的細微代謝差異。

                  如圖7 Figure 7主成分(PCA)分析圖所示,此研究對所有尿液代謝物譜進行主成分分析(PCA)(圖7)。第14天的尿液的樣品因為參與者當天沒有吃標準飲食,此樣品數據被作為溢出值剔除。主成分分析(PCA)得分圖顯示了在攝取普洱茶之前,期間和之后獲得的受試者尿液樣品代謝物數據的聚類分析。 相應的主成份分析載荷圖和S-(S-plot)顯示,導致代謝數據產生聚類的主要的差異代謝物因素包括尿液中肌醇,肉豆蔻酸,5-羥色氨酸和4-甲氧基苯乙酸濃度的增加,及肌酸酐,3-氯酪氨酸和酪胺濃度的減小,參見表4Table 4)。

                  master.img-006.jpg


                  Figure 7. Trajectory of PC1 vs PC2 scores for UPLC-QTOFMS data of urine samples collected during the predose phase, pu-erh tea intake phase, and postdose phase. Each dot denotes mean score at different time points (e.g., predose period (day 1, day 7), “dosing” period (day 16, day 21, day28), and postdose period (day 30, day 36, day 42)


                  Table 4. Changes of Metabolites Observed in Human Urine Obtained after Pu-erh Tea Intake and the Contribution of Each Metabolite.

                  retention time(min)

                  metabolite

                  VIP rank

                  0.97

                  inositol

                  3()

                  1.45

                  myristic acid

                  4()

                  2.01

                  5-hydroxytryptophan

                  5()

                  2.19

                  4-methoxyphenylacetic acid

                  1()

                  0.71

                  creatinine

                  8()

                  1.03

                  3-chlorotyrosine

                  7()

                  1.15

                  tyramine

                  6()

                              2.01pyroglutamic acid  2()

                  represents significantly elevated concentration, whereas represents significantly lowered concentration.

                  普洱茶攝入的影響。 在這項研究中,對10名男性和10名女性在普洱茶飲用期之前(第1,714天),普洱茶飲用期間(第16天,第21天和第28天)以及普洱茶飲用期之后,(第30,3642天)的尿液樣品使用UPLC-QTOFMS技術進行了分析。 典型的樣品的基峰信號強度色譜圖(BPI)如圖6Figure 6. )所示。 主成分分析法(PCA),作為一種是一種無監督模式判別法,在本研究中采用以提高分析的準確度。圖7的主成分分析PCA得分圖的軌跡揭示受試者在攝取普洱茶之前,期間和之后尿液中代謝物的數據明顯被參數主成分1PC1)分離。三種樣品由主成分1PC1)清楚地分開; 該圖還顯示,受試者飲用普洱茶期間,受試者得的代謝數據相對于飲用普洱茶之前的數據偏離基線(由參數PC1決定),在停止服用普洱茶后受試者代謝數據又返回基線,盡管如此受試者停止飲用普洱茶之后的數據仍然不同于飲用普洱茶之前的數據。


                  代謝組學-脂質-代謝流-靶向定量

                  Figure 8.  Scores plot (t[1] vs t[2]) generated from OPLS-DA of UPLC-QTOFMS spectra from control


                  代謝組學-脂質-代謝流-靶向定量

                  Figure 9.  S-plot of the differentiate metabolites.

                  我們在隨后構建三組分偏最小二乘方判別分析(PLS-DA)模型(R2X0.606,R2Y0.927,Q2Y0.821)以判定決定對照組和普洱茶攝取組的代謝模式的分離的差異代謝物。 4總結了決定尿液中代謝譜差異的差異代謝物組。人尿液代謝物受性別影響,如圖8所示(Figure 8)普洱茶攝入過程中男性和女性受試者的代謝產物可以由 PC2t [1])顯著的分離,這一點已經由Wang等人討論過。另有研究報道,普洱茶代謝的尿液數據可因飲食和收集時間差異而產生數據分離。 所有這些因素對代謝特征的影響都會模糊普洱茶飲用這一特定飲食干預的代謝效果。 為了確定專門針對普洱茶的代謝變化,我們建立了標準飲食和固定的尿液樣品的收集時間。

                  使用S-plot模型來呈現普洱茶攝入前和普洱茶攝入期間的差異代謝物,見圖9Figure 9)。表4列出了重要的差異代謝物及其變化重要性參數VIP值,VIP值是表征變量對模型的影響的程度的度量數值。最重要的影響因素包括尿液中4-甲氧基苯乙酸、肌醇、肉豆蔻酸和5-羥色氨酸的濃度增加,以及尿液中3-氯酪氨酸、酪胺、肌酐的濃度的降低(圖9和表4)。據報道、肌糖(纖維醇)可以降低膽固醇水平,因此普洱茶攝入過程中尿液代謝物中肌醇水平的增加可以部分解釋文獻中報道的普洱茶降膽固醇作用。 3-氯酪氨酸是髓過氧化物酶催化氧化的特異性標志物,3-氯酪氨酸的濃度在從人動脈粥樣硬化血管分離的低密度脂蛋白(LDL)中顯著升高。3-氯酪氨酸水平的降低是低密度脂蛋白(LDL)濃度降低的表征,也說明了普洱茶降低血漿甘油三酯的機制。 5-羥色氨酸作為必需氨基酸—色氨酸,以及5-羥色胺(血清素)生物合成的中間體,可提高5-羥色胺水平,從而有助于預防頭痛,減輕體重,緩解壓力和失眠。 5-羥色氨酸也是臨床上重要的神經藥物。觀察到肌酐濃度減少的原因尚不清楚。然而,眾所周知,氧化反應激促進肌酐從尿液排泄,據報道抗氧化劑可減少兔的尿肌酐。因此,普洱茶的抗氧化活性可能導致普洱茶攝入后尿液中肌酐水平降低。

                  對比在普洱茶攝入期后的2周內與普洱茶攝入前的兩周的尿液樣品(圖8支持信息圖參見圖S6(Figure 8 Figure S6)發現:受試者在普洱茶攝入期結束后兩周,尿液代謝數據沒完全恢復到攝入普洱茶前的水平。這一個現象可以用普洱茶對腸道微生物菌群的抗菌活性來解釋。已經有研究顯示尿液中肌酸酐和其他代謝物質的濃度受微生物調節。報道3-氯酪氨酸有促進腸道微生物生長的活性,3-氯酪氨酸在普洱茶攝取階段的在尿液中濃度的減少可能促使了腸道微生物的減少。有研究已經證明普洱茶具有抗菌活性,因此攝取普洱茶后可能需要超過2周的時間來重新建立腸道微生物群。腸道微生物對腸上皮的發育和結構,對于腸道的消化和吸收能力以及宿主免疫系統功能產生深遠的影響;因此,此研究的結果預示著飲用普洱茶會影響腸道微生物群進而對人體的健康產生影響。確定在普洱茶攝入過程中受試者腸道微生物群落的變化將有助于了解普洱茶飲用的功能。

                  總之,我們應用基于質譜(MS)技術的代謝組學方法來評估了普洱茶、紅茶和綠茶的組成成分,以及飲用普洱茶的生物學效果。我們發現茶葉加工過程的差異導致茶葉化學成分和茶葉沏泡液顏色的不同。綠茶的特征成分為多酚和茶氨酸,紅茶的特征成分為茶黃酸(TFA)和茶紅玉素(TR),普洱茶的特征成分為茶褐素(TB)和沒食子酸(GA)。我們還發現尿液中代謝物數據特征受到飲用普洱茶這一飲食干預的影響,在普洱茶攝入期間尿液中代謝物數據偏離基線,并且在2周洗脫階段尿液中代謝物數據回歸到接近基線的模式。結果發現,尿液中肌酐濃度的降低和4-甲氧基苯乙酸,肌醇,肉豆蔻酸,5-羥色氨酸的濃度的升高與普洱茶的攝入量密切相關。此外,普洱茶攝入的代謝后果在普洱茶攝入期之后的2周內持續存在,普洱茶攝入期后的腸道菌群微生物區系沒恢復到攝入前的水平。此研究是朝著全面了解普洱茶及其對人體新陳代謝的影響邁出的重要一步。并且有必要來進一步進行藥理學研究以闡明普洱茶的代謝作用。 

                  縮寫的解讀

                  UPLC-QTOFMS,超高效液相色譜 - 四極桿飛行時間質譜; PCA,主成分分析;PLS-DA,偏最小二乘方判別分析; ANN,人工神經網絡; BPI,基峰強度; VIP,變量重要性參數;EGC,表沒食子兒茶素; EGCG,表沒食子兒茶素沒食子酸酯; ECG,表兒茶素沒食子酸酯;GCG,沒食子兒茶素沒食子酸酯;TR,茶紅玉素; TF,茶黃素;TFA,茶黃酸; TB,茶褐素; GA,沒食子酸。

                  致謝

                  我們感謝志愿者幫助完成這項研究。

                  可獲得的支持信息:茶樣品的來源(表S1/ Table S1;普洱茶,紅茶和綠茶的化學成分比較(表S2/ Table S2; 通過雙組分正交偏最小二乘方(OPLS)模型(R2Y=0.994,Q2Y=0.991)判別綠茶中(與紅茶相比較)的VIP值的差異代謝物的總結表見表S3Table S3),↑代表顯著升高的濃度,而↓代表顯著降低的濃度); 通過雙組分正交偏最小二乘方(OPLS)模型(R2Y=0.999,Q2Y=0.995)判別紅茶中(與普洱茶相比)的VIP值的差異代謝物的總結表見表S4Table S4),↑代表顯著升高的濃度,而↓代表顯著降低的濃度);通過雙組分正交偏最小二乘方(OPLS)模型(R2Y=0.999,Q2Y=0.995)判別綠茶中(與普洱茶相比)的VIP值的差異代謝物的總結表見表S4Table S4),↑代表顯著升高的濃度,而↓代表顯著降低的濃度);尿液稀釋參數見表S6(Table S6);使用偏最小二乘方判別分析(PLS-DA)得分圖描述綠茶和紅茶樣品之間的UPLC-QTOFMS色譜檢測代謝譜差異見圖S1Figure S1);使用偏最小二乘方判別分析(PLS-DA)得分圖描述描述普洱茶和紅茶樣品之間的UPLC-QTOFMS色譜檢測代謝譜差異見圖S2Figure S2); 使用偏最小二乘方判別分析(PLS-DA)得分圖描述普洱茶和綠茶樣品之間的UPLC-QTOFMS色譜檢測代謝譜差異見圖S3Figure S3);用不同體積的超純水稀釋的尿液樣品的UPLC-QTOFMS基峰強度(BPI)色譜圖見圖S4Figure S4);用2倍體積的超純水和0.1%甲酸溶液稀釋的尿液樣品的UPLCQTOFMS基峰強度(BPI)色譜圖見圖S5 Figure S5);對普洱茶攝取期間和普洱茶攝入后的UPLC-QTOFMS代謝普數據進行正交偏最小二乘方判別(OPLS-DA)分析(t [1] vs t [2])的得分圖見圖S6Figure S6)。這些資料可通過互聯網免費獲取,網址為http://pubs.acs.org。

                   

                  文獻內容

                  Title: Characterization of Pu-erh Tea Using Chemical and Metabolic Profiling Approaches

                  Author: GUOXIANG XIE, MAO YE, YUNGANG WANG, YAN NI, MINGMING SU, HUA HUANG, MINGFENG QIU, AIHUA ZHAO, XIAOJIAO ZHENG, TIANLU CHEN, AND WEI JIA

                  Journal:  J. Agric. Food Chem. 2009, 57, 3046–3054

                  Keywords: UPLC-QTOFMS; pu-erh tea; metabonomics; multivariate statistical analysis

                  Abstract
                  In this study, the chemical constituents of pu-erh tea, black tea, and green tea, as well as those of pu-erh tea products of different ages, were analyzed and compared using a chemical profiling approach. Differences in tea processing resulted in differences in the chemical constituents and the color of tea infusions. Human biological responses to pu-erh tea ingestion were also studied by using ultraperformance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-QTOFMS) in conjunction with multivariate statistical techniques. Metabolic alterations during and after pu-erh tea ingestion were characterized by increased urinary excretion of 5-hydroxytryptophan, inositol, and 4-methoxyphenylacetic acid, along with reduced excretion of 3-chlorotyrosine and creatinine. This study highlights the potential for metabonomic technology to assess nutritional interventions and is an important step toward a full understanding of pu-erh tea and its influence on human metabolism.

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