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                  案例分享

                  基于GC - MS的代謝組學研究揭示:SD大鼠和Wistar大鼠之間存在系統的代謝差異及乙醇灌胃反應差異

                  發布日期:2019.08.22

                  寫在前面:

                  大鼠被譽為精密的生物研究工具,被廣泛用于內分泌、藥物、行為學、老年病學、腫瘤、感染性疾病、心血管疾病及中醫藥等方面的研究,并具有多個品種、品系,可供不同實驗選用。在分類上主要包含封閉群大鼠和近交系大鼠兩大類。Sprague-DawleySD)大鼠和Wistar大鼠屬于封閉群大鼠的類別。封閉群大鼠指不以近交形式,也不與群外動物雜交而繁衍的大鼠動物群,保持群體的一般特性,又保持動物的雜合性。

                   

                  讓小編帶大家來分享一篇經典的使用大鼠作為研究對象的代謝組學技術方面的文獻。本次分享的文獻(譜領技術人員完成)主要針對封閉群大鼠中的SD大鼠和Wistar大鼠進行代謝差異研究。Wistar大鼠對各種營養物質更敏感,適用于各種營養、代謝性疾病研究。其垂體腎上腺系統發達,應激反應靈敏,因此也適用于神經-內分泌實驗研究。還可用于藥物、腫瘤、傳染病、關節炎和肝膽外科等醫學研究領域及藥理、毒理和生物制品等研究。SD大鼠由Wistar大鼠培育而成,其性情較Wistar大鼠更為兇猛,且比Wistar大鼠具有更強的適應性和抗病能力,因此也更為受到動物實驗的青睞,也是較為重要的實驗大鼠品種。常用于營養學、內分泌學和毒理學研究。

                   

                  讓我們來看看本篇文獻的設計思路、實驗方法和結果:

                  SD大鼠和Wistar大鼠是具有相似遺傳背景的常用實驗大鼠,在實際的科研中研究人員們認為兩種大鼠是可互換的。在這篇文章中,研究者利用基于氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)的代謝組學技術,分析了SD大鼠和Wistar大鼠在不同擾動,如:禁食、喂飼和連續急性乙醇干預影響下的系統代謝差異。實驗揭示:兩種大鼠的代謝差異包含若干代謝途徑的差異和腸道共生微生物區系的差異。實驗結果表明,與Wistar大鼠相比,SD大鼠在禁食和攝食狀態下表現出更高的個體化代謝變異,以適應環境變化,連續乙醇灌胃對SD大鼠造成的肝損傷要弱一些,SD大鼠表現出更強的適應和恢復能力,以適應連續乙醇灌胃擾動,恢復原有的代謝特征??偟膩碚f,作者通過基于GC-MS代謝組學的尿樣分析研究證明:SD大鼠和Wistar大鼠之間存在內源代謝差異。本結果對于今后使用這類動物進行各類的實驗設計有參考價值。

                   

                  文獻解讀:

                   

                  1.         引言

                  實驗動物的遺傳和生理多樣性為藥理學、毒理學和營養學研究帶來越來越多的挑戰,研究者們關心如何選擇適合的研究對象,如何以最低的成本獲得最優的研究結果。因此有研究者記錄了常用的具有相似遺傳背景的不同的實驗動物之間對藥物、營養素和壓力的易感性的差異。已知各種內在生理因素和外部影響會影響體液中的代謝物組成,內在生理因素包括物種、品系、遺傳修飾、性別、年齡、生理節律和個體間變異,外部影響包括晝夜變化、壓力和腸道微生物群落。SD大鼠和Wistar大鼠在代謝和遺傳上是非常相似,是實驗室常用的嚙齒動物。在此之前,Holmes等人(2000)使用基于核磁共振(NMR)技術的代謝組學技術研究兩種大鼠的代謝差異,通過主成分分析(PCA)發現SD大鼠和Wistar大鼠尿液中的代謝物存在差異,同時又使用概率神經網絡理論分析,發現了這兩種大鼠的代謝特征差異明顯。

                   

                  在平臺的選擇上,迄今為止,大多數此類研究是使用基于NMR的代謝組學方法進行的,該方法主要由Nicholson及其同事開創。然而,關于SD大鼠和Wistar大鼠之間代謝差異的研究僅有基于NMR的代謝組學技術來開展的。相關研究者認為基于替代技術平臺探索SD大鼠和Wistar大鼠之間的差異的研究也是至關重要的,并可為NMR技術的研究結果提供補充信息。質譜分析,特別是與先進的色譜分離儀器相結合,因為具有更寬的動態范圍,可重復的定量能力,以及分析顯著分子復雜性的樣品的能力,所以是代謝組學研究的有力工具。氣相色譜與質譜聯用(GC- MS)的靈敏度和分辨率比傳統的核磁共振方法更好,顯然是一種可靠的方法,相關文獻報道,其與液相色譜-質譜聯用(LC - MS)相比,對候選生物標志物的結構鑒定具有更好的可靠性。迄今,非靶向GC - MS分析已成功應用于尿液,血清樣品和組織提取物的代謝組學分析。

                   

                  至于研究意義,理解SD大鼠和Wistar大鼠之間的代謝差異及具體差異代謝物有助于幫助研究者增進對這兩種大鼠各自的特征的認識及改進后續的數據解讀。本篇文獻中的研究是利用GC-MS代謝組學技術比較禁食和攝食狀態中的兩種大鼠的代謝差異,并比較SD大鼠和Wistar大鼠對外部干預(急性乙醇暴露)的不同反應。 該研究還觀察了兩種大鼠對生活環境突變的壓力反應,及他們各自的內源性的獨特變化。同時還測定血清和肝組織的生理參數,以支持急性乙醇干預實驗中代謝組學的結果。

                   

                  2.         實驗材料和方法

                  1)        實驗動物

                  8周齡的雄性SDWistar大鼠購自上海實驗動物有限公司(中國),并分別飼養在不銹鋼標準籠中(每籠5SD大鼠Wistar大鼠),在培養過程中為大鼠提供經過認證的標準大鼠飲食和可以自由飲用的水。在環境受控的大鼠培養室中維持恒定的12小時光/暗循環,室內的恒定為溫度為23±1,濕度為60±5%。 適應1周后,將大鼠分組以進行以下實驗。 另外,除非另有說明,否則所有大鼠都飼養在提供標準飲食可隨意飲用的水的標準籠中。參照《中國實驗動物護理和使用指南》的原則和程序進行實驗動物護理和使用。 實驗設計如圖1Figure 1所示。)

                   

                  2)        實驗的設計

                  實驗的設計I :禁食的和喂食的狀態下SD大鼠和 Wistar大鼠的比較

                  如圖1Figure 1實驗一)所示:(A)將已經在代謝籠中適應一周的兩種大鼠各20只,分別轉入代謝籠。從第1天的第18小時到第2天的第9小時處于禁食狀態,水可以自由飲用。在第3天到第4天的相同的時間,重復相同的禁食過程,在這個過程中兩種大鼠也是只能喝水。收集兩種大鼠的尿樣,來進行GC-MS分析,以確定禁食期間的大鼠夜尿中的代謝物成分。(B)從第五天的第18個小時到第6天的第9個小時,在代謝籠中放入可隨意取用的食物和水。收集尿液來進行GC-MS分析,以確定喂飼狀態下的大鼠夜尿成分。

                  代謝組學-脂質-代謝流

                   Figure 1: Flowchart of experiment designs in this study. All rats could drink water freely during the whole experiment. Key: 8 w 8-week old, SC standard cage, MC metabolism cage; 18 h(9 h), 18:00 (9:00); d1(d2,…,d13), the 1st (or 2ed,…,13th) experimental day after the initial 1 week of adaption in standard cages

                   

                  實驗的設計II:急性乙醇灌胃干預下SD大鼠和 Wistar大鼠的系統比較

                  如圖1Figure 1實驗二)所示:在之后的第6和第7天兩天,將實驗的設計I中的雄性SD大鼠和Wistar大鼠各20只轉入標準飼養籠中兩天,并提供可以自由取用的食物和水。之后的第8到第13天中,SD大鼠和Wistar大鼠被各分為兩組,每組有同種的10只大鼠,共4組。同種大鼠中有一組在第8天的第18小時到第9天的第9小時之間用乙醇灌胃,具體的方法是:以8ml 50%的乙醇每千克體重的量灌胃兩次,兩次的灌胃間隔1小時。相同的灌胃的過程連續5天重復進行。對照組大鼠(每一種對照組含10只)以相同的方式用蒸餾水灌胃。在每天灌胃處理后,立即將大鼠放入代謝籠,并收集每天的第18個小時到下一天的第9個小時的夜尿樣品以進行GC-MS分析。 在第13天第9個小時后,犧牲所有的大鼠,并收集血樣和肝臟組織進行肝臟的損傷的分析。

                   

                  3)        血清和肝組織的樣品制備和生化測定

                  將血樣立即在9,300×g4℃條件下離心15分鐘,轉移上清液(血清),用以確定生化參數。從犧牲的動物中快速切除肝組織并儲存在-80℃。在分析之前,將肝組織加冰冷的鹽溶液作勻漿化處理,隨后將混合物在9,300×g4℃下離心15分鐘。上清液用于測定肝臟生化參數。

                   

                  血清酶活性的測定,如:丙氨酸氨基轉移酶(ALT),天冬氨酸氨基轉移酶(AST)和乳酸脫氫酶(LDH)在自動分析儀(Roche / Hitachi,Modular P800)上來進行分析。此分析實驗采羅氏試劑并在臨床生化實驗室中進行。使用試劑盒(中國建城生物工程研究所)測定肝組織酶活性,方法是:使用蛋白質試劑盒分析組織蛋白質含量。使用基于黃嘌呤氧化酶法的SOD試劑盒測量超氧化物歧化酶(SOD)活性。使用該試劑盒在37℃下反應40分鐘后,在550nm的波長下測量OD值。一個SOD酶活力的單位定義為SOD抑制四氮唑藍(NBT)光還原相對百分率為50%時的酶量作為一個酶活力單位。使用GSH-PX試劑盒測定谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活性。一個單位的GSH-PX酶活力等于在1分鐘內分解1μM的谷胱甘肽(GSH)所需的酶量,酶比活使用單位: 活力單位數/分鐘/毫克蛋白(units/min/mg protein來表示。使用丙二醛試劑盒測定肝臟的脂質過氧化(LPO)。酶活性檢測方法是基于酶催化反應形成生紅色發色團,在532nm處有光吸收,酶活的測定結果表示為納摩爾丙二醛/毫克蛋白質(nmol/mg)。

                   

                  4)        尿液樣品的制備和GC / MS分析

                  收集到的大鼠的尿液樣立即在5,900×g4℃條件下離心10分鐘以除去任何固體碎渣,并將上清液以等分試樣的方式儲存在-80℃,以進行后續的衍生化。 參照Qiu等人在2007公布的方法,使用氯甲酸乙酯對尿液樣品進行衍生化并進行GC / MS分析。使用L-2氯苯丙氨酸作為此實驗的一種內標(IS),用于來監測整個實驗過程中GC-MS平臺的性能和及實驗方法的重現性。

                   

                  5)        GC / MS數據的提取和多變量統計分析

                  使用Agilent GC-MS 5975數據分析軟件處理原始GC-MS數據,將原始數據轉換為AIA格式(NetCDF)文件,隨后可使用XCMS工具箱(版本1.14.0)處理得到的AIA格式文件,參數的設置請參照Gao 等在2009文獻所報道的參數。由XCMS工具箱得到的結果,可使用Microsoft Excel軟件(Microsoft,Redmond,WA)進一步處理,內標所產生的峰值、因為柱流失和衍生化過程而產生的雜質峰將被排除,剩余的離子特征峰被歸一化到總積峰面積,為保留數據精確,每個峰面積乘以1000,其所占的總峰面積比例為除以1000倍總峰面積的值。 所得到的數據被排列在三位矩陣中,并包含保留時間,核質比,樣品的名稱,峰面積等峰參數信息。

                   

                  將得到的三維矩陣導入Simca-P 11.0軟件包(Umetrics,Ume?,Sweden)。使用中心平均值法 meancentered)或者比例標準偏差法 UV-scaled)對數據進行標量化,對于標量化后的數據進行主成分分析(PCA),在主成分得分數圖上將顯示所有樣本中的一般聚類,趨勢和異常值。 R 2 X表示當前模型的累積解釋能力,其中接近1的值表示優秀的模型。同時對兩種大鼠的乙醇灌胃組和對照組數據進行偏最小二乘判別分析(PLS-DA)。參照Bylesj?等人在2006年使用的方法對數據進行正交偏最小二乘判別分析,構建預測模型,以判別兩種乙醇灌胃和對照大鼠的差異代謝物。R 2 YY中的累積模型變化,Q 2 YY中的累積預測變化。這些參數的值接近1.0表示具有預測可靠性的穩定模型。差異代謝物的判定方法是使用VIP值和P值來判定,VIP值是從最小偏二乘(OPLS-DA模型獲得的變量顯著性投影值(VIP), P值是通過雙尾T檢驗獲得,在獲得VIP值和P值時,使用的是基于單變量分析水平的歸一化處理后的原始數據。 當某種代謝物數據的VIP值大于1.0P值小于0.05時,即可判定此物質為差異代謝物。折疊變化計算為兩個任意類別之間的平均質量響應(面積)比率的對數,其中正值表示第1類的平均質量響應大于第2類的平均質量響應。

                   

                  6)        差異代謝物的鑒定

                  首先通過將每種化合物的保留時間、質譜圖與我們實驗室中的標準品的保留時間、質譜圖做比較來鑒定代謝物的種類。 沒有標準品的代謝物則通過對比商業數據庫如NIST05來鑒定。去卷積化的質譜圖譜由自動質譜解卷積和識別系統(AMDIS)生成,并被轉換到NIST質譜搜索程序MS Search 2.0中,通過和MS Search 2.0程序所帶的NIST標準品的質譜數據庫進行比對,鑒別代謝物的種類。

                   

                  3.         實驗的結果和討論:

                  1)         大鼠尿液中代謝物質的GC - MS分析結果

                  通過對對色譜圖進行簡單的直觀檢查發現,SD大鼠和Wistar大鼠的尿液樣品中共有的化合物是三羧酸(TCA)循環中間體(琥珀酸、烏頭酸和檸檬酸),脂肪酸(辛二酸和硬脂酸)氨基酸(甘氨酸、賴氨酸、酪氨酸和色氨酸)和芳香族化合物(對甲酚、4-乙基苯酚、馬尿酸、苯乙酰甘氨酸、苯甲酸、4-羥基苯乙酸、3-羥基苯丙酸和3,4-二羥基苯乙酸)。實際上,具有相似或甚至相同基因型的群體在相同和相似的生活環境中生活時個體間代謝變異是普遍存在的。為了全面比較SD大鼠和Wistar大鼠這兩種品系之間的系統代謝變異,本研究使用代謝組學常用的統計學分析手段:主成分分析法(PCA,偏最小二乘分析法對兩種大鼠的尿液中代謝物的GC - MS檢測數據進行了統計學分析。

                   

                  2)         兩種大鼠對于禁食的代謝反應

                  外界的壓力會影響復雜的生化調節系統,并可能導致明顯的代謝中斷和神經心理疾病癥狀,如:高血壓、胃潰瘍、抑郁、焦慮、冷漠和胃腸功能紊亂等疾病。 在這項研究中,研究者首先對實驗數據進行了主成分分析(PCA)。通過對大鼠尿液樣品的數據進行主成分分析,研究者發現一些明顯異常的溢出值數據。SD大鼠和Wistar大鼠在禁食實驗第1天(d1)溢出值數據比禁食實驗第3天(d3)多。在實驗第5天(d5)即攝食狀態的溢出值數據比禁食實驗第3天(d3)多。研究者通過比較重復制備樣品的GC / MS總離子流色譜圖,進一步驗證了這些異常的溢出值,并在最終分析中去除了這些溢出值。

                   

                  在去除尿樣GC-MS數據所有異常值后,使用統計學方法---主成分分析法(PCA)分析數據,得到了如下的PCA得分圖,見圖2 Figure 2),PCA得分圖顯示:Wistar大鼠禁食第1天(d1)和第3天(d3)的尿液代謝物數據有顯著的差異,見圖2d Figure 2d, SD大鼠禁食的第1天(d1)和第3d3)的尿液代謝物數據也表現出明顯的分離趨勢,數據的差異很明顯,見圖2a Figure 2a。這和Holmes等人在2000年的發現有所不同,Holmes等人在8天的實驗期間收集SD大鼠和 Wistar大鼠的尿液樣品,發現其代謝物數據不存在與采樣時間相關的差異。盡管本實驗僅僅在d1d3收集了禁食的大鼠的尿液,但我們進一步檢查了時間相關的差異是否也存在于隨后的急性乙醇干預實驗中(實驗II,d8,d10d12)的對照組中。 PCA得分圖顯示,乙醇灌胃實驗對照組的SD大鼠和Wistar大鼠,的不同時間點之間未發現代謝物的類型和濃度的顯著的差異,見圖2c,f Figure 2c,f。這樣的結果意味著兩種大鼠對灌胃處理沒有明顯的反應。

                  代謝組學-脂質-代謝流

                  Figure 2: PCA and PLS-DA scores plots of GC/MS urinary data comparing SD rats a, b and Wistar rats d, e in fasting (d1 and d3) and feeding state (d5), and comparing three consecutive time points of control groups of SD rats c and Wistar rats f in ethanol intervention. Key: diamond, triangle, and star represent the first (d1), third (d3), and fifth (d5) day of SD or Wistar rats, respectively; box, dot, and invert triangle represent the control samples of first (d8), third (d10), and fifth (d12) ethanol intervention, respectively  

                   

                  使用偏最小二乘法分析法(PLS-DA)分析數據,以洞察在實驗d1 (禁食)、d3 (禁食)d5 (正常的喂飼)時尿液代謝物數據間差異。如圖(圖2b,e所示:由飲食的差異造成的d3 (禁食)、d5 (正常的喂飼)的代謝物數據差異SD大鼠PC2 10.8%),Wistar大鼠 PC28.6%)),明顯的小于d (禁食)、d3 (禁食)的代謝物數據間差異(SD大鼠PC122.1%),Wistar大鼠PC1 23.5%))。大鼠在禁食的d1因為生活環境的變化,即從標準飼養籠轉入代謝籠,導致了d1和第d3代謝數據的明顯的差異。在這一項研究中,所有的實驗大鼠在正式的實驗之前,都被放置在標準飼養籠喂飼一周,從標準飼養籠到代謝籠的生活環境變化導致了代謝物的劇烈變化。

                   

                  通過分析d1d3之間的差異代謝物發現,生活環境的突變和和禁食共同的造成了某些芳族代謝物(包括馬尿酸、3-羥基苯基丙酸、吲哚-3-乙酸、3-羥基苯甲酸、4-乙基苯酚、1,2-二羥基苯,對羥基桂皮酸)、β丙氨酸和甲基丙二酸濃度的顯著降低,同時也引起了如下代謝物的濃度明顯的提高:二羧酸(包括丙二酸、乙醇酸、己二酸、辛二酸的、和壬二酸)、長鏈脂肪酸(包括棕櫚酸和硬脂酸)、另一些芳香族代謝物(包括4-羥基苯甲酸、4-羥基苯乙酸和苯乙酰甘氨酸)和氨基酸(包括脯氨酸和丙氨酸)。據報道,芳香代謝物的變化與腸道菌群的活性密切相關。大鼠的尿液中短鏈二羧酸和長鏈脂肪酸的濃度上調提示:在持續禁食的外界壓力下機體通過啟動生物催化的脂肪酸降解途徑利用脂肪酸產生能量。以上的結果表明,生活環境的突然變化不僅強烈影響實驗動物的新陳代謝,而且還引起共生腸道微生物群落的相應調整。因此,SD大鼠和Wistar大鼠的都表現出明顯的空腹依賴型代謝反應。

                   

                  3)         SDWistar大鼠在禁食和攝食狀態下的代謝組學差異

                  為了在直觀的描繪兩種大鼠品系在禁食和攝食狀態下的代謝組學差異,去除有溢出值數據的樣品,對其余樣品的數據進行主成分分析(PCA)。PCA評分圖(3/Figure 3):顯示SD大鼠和Wistar大鼠在禁食時在d1(圖3a)和d3(圖3b)代謝物的數據分離良好,有明顯的差異。在喂養狀態下,即在d5SD大鼠和Wistar大鼠之間代謝物的數據分離良好(d5,圖3c,有明顯的差異。在利用這個模型進行數據分析時,R2X值大于0.6,可推斷所有PCA模型的質量都很好。并且將模型用于預測喂飼大鼠的部分數據,可看到T-預測PCA得分圖(圖3d)數據的符合度良好,說明了當前模型具有良好預測能力,可解釋差異群體之間的主要差異。 因此,可認為SD大鼠和Wistar大鼠之間表現出顯著的生理差異。



                  代謝組學-脂質-代謝流

                  Figure 3: Scores plots of PCA on nocturnal urinary GC/MS data between SD and Wistar rats in fasting and feeding states. a Fasting SD rats (n = 16) versus fasting Wistar rats (n = 17) on d1; b fasting SD rats (n = 19) versus fasting Wistar rats (n = 18) on d3; c feeding SD rats (n = 18) versus Wistar rats (n = 17) on d5; and d T-predicted PCA scores plot between feeding SD rats and feeding Wistar rats. Key: box SD rats, triangle Wistar rats, square predicted SD rats, open triangle predicted Wistar rats.

                   

                  4)         禁食或喂養時區分SDWistar大鼠的代謝產物的差異

                  為確定導致兩種大鼠尿液代謝組差異的關鍵代謝物,選擇在正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)中VIP值大于1及在t檢驗(student’s t test)分析時P值小于0.05的代謝物作為差異化合物,如表1Table 1)所示。在禁食狀態下,Wistar大鼠排出更多的琥珀酸和氨基酸,如賴氨酸、焦谷氨酸和N-乙酰天冬氨酸,而SD大鼠排出更多的芳香族代謝物。當兩種大鼠喂食相同的食物時,與SD大鼠相比,Wistar大鼠明顯排出更多的琥珀酸和檸檬酸,并且其排出的芳香族代謝物更少。

                   

                  Table 1: The differential metabolites between nocturnal urines of SD and Wistar rats in fasting (d3) and feeding states (d4)

                  代謝組學-脂質-代謝流

                  aThese compounds were validated by reference standard substances.

                  在這項研究中,通過對實驗數據進行主成分分析(PCA)揭示:兩個大鼠品系在禁食和攝食狀態下代謝數據明顯分離。如表1Table 1)所示,標志兩種大鼠的代謝區別的代謝物是脂肪酸、氨基酸和芳香族化合物。曾經有報道指出,線粒體中脂肪或支鏈氨基酸的代謝紊亂通常導致大量甲基丙二酸或乙基丙二酸在組織和體液中的積累。該實驗結果清楚地表明,Wistar大鼠產生比SD大鼠更高水平的兩種代謝物即甲基丙二酸、琥珀酸。Mirandola等人在2008的研究表明,甲基丙二酸可抑制線粒體中琥珀酸的氧化,因此與空腹SD大鼠相比,較高濃度的琥珀酸與甲基丙二酸由空腹Wistar大鼠尿液中一起排出。此外,有趣的發現是SD大鼠尿液樣品中的乙基丙二酸和甲基琥珀酸在禁食條件下均顯著高于Wistar大鼠,這表明SD大鼠可能比Wistar大鼠產生更高水平的與乙基丙二酸腦病有關的代謝物。由此我們推斷,在禁食狀態下SD大鼠和Wistar大鼠的脂肪和支鏈氨基酸代謝都發生紊亂現象,且SD大鼠和Wistar大鼠兩者之間存在顯著的代謝紊亂差異。

                   

                  如圖3 Figure 3)的主成分分析(PCA)得分圖顯示,SD大鼠數據的輪廓更分散,因而SD大鼠表現出更高的個體代謝變異常,而Wistar大鼠數據的輪廓更加的緊密些,因而其個體代謝變異相對較小。研究者通過分析差異代謝物發現,禁食的SD大鼠的尿液中芳香族代謝物比禁食的Wistar大鼠更多,與Wistar大鼠相比,喂食進一步促進SD大鼠排泄更多的芳香族代謝物,見表1Table 1)。已知酚酸通常與腸道菌群轉化芳香族氨基酸和膳食中的酚類物質的代謝相關。我們認為同種大鼠品系內的個體間變異可能與它們的共生腸道菌群有關,這被認為是一個密切影響代謝特征的外部因素。因此,與Wistar大鼠相比,腸道微生物區系可能在SD大鼠中發揮更大的作用。已知一些口服藥物和食物成分通常在被吸收之前經歷腸道微生物的降解,轉化或解毒。因此,在動物水平進行研究時,應考慮不同實驗動物品系之間的這種差異。

                   

                  5)         急性乙醇干預引起的代謝組學反應多樣化 急性乙醇干預引起的代謝組學變異

                  在隨后的急性乙醇干預實驗中選擇喂養的大鼠,是由于以下兩個原因:(1SDWistar大鼠的尿液代謝物數據在喂養時下較禁食下具有更相似的分離狀態,見圖3 Figure 3);(2)根據初步實驗,與禁食相反,使用已喂食過的大鼠做乙醇灌胃實驗可有效減少乙醇給藥期間實驗大鼠的死亡。盡管在第1次的乙醇干預(d8)(第8天)后,SD大鼠和Wistar大鼠的對照組數據主成分分析(PCA)得分圖中PC1PC2參數沒有觀察到數據分離(圖中未顯示),主成分分析(PCA)得分圖中PC2PC4項出現明顯分離,見圖4a Figure 4a)。同樣,SDWistar大鼠的對照組之間的清晰的數據分離僅存在于第3天乙醇干預后的PCA得分圖的PC1PC4項,見圖4bFigure 4b),或第5天乙醇干預后的PC2PC3項,見圖4c Figure 4c)。盡管在PCA評分圖中數據的分離能力降低,但目前的工作表明兩種對照大鼠之間確實存在代謝差異,這與正常生理條件下的相似,參見圖2cFigure 2c)。


                  代謝組學-脂質-代謝流

                  Figure 4: Scores plots of SD and Wistar rats by the consecutive ethanol exposure (d8, d10, d12). ac the comparison of the control groups between SD and Wistar rats in three repeated ethanol intervention (PCA); df the comparison between the control group and ethanol group of SD rats and Wistar rats (PLS-DA). Key: dot ethanol SD rat, box control SD rat, diamond ethanol Wistar rat, and triangle control Wistar rat.

                   

                  為了減少噪音數據干擾,提高信噪比,使用偏最小二乘統計分析法(PLS-DA)分析大鼠尿液的GC-MS檢測數據,以評估乙醇干預對大鼠代謝特征的影響。圖4dFigure 4 d)顯示,對于SD大鼠或Wistar大鼠,第1次急性乙醇干預(d8)引起尿代謝物譜顯著的改變。進一步發現,在第3次乙醇干預(d10)后,見圖4eFigure 4 e,SD大鼠的乙醇組和對照組傾向于在PLS-DA的評分圖上重疊,并且在第5次乙醇干預后這種重疊的趨勢進一步加強(d12),見圖4Figure 4 f)。該結果暗示SD大鼠可能具有強烈的自我調節能力適應乙醇灌胃。圖4dFigure 4 d)還表明,對Wistar大鼠的第1次急性乙醇干預導致與PLS-DA評分圖上的對照組明顯分離,并且在第3次(圖4e)和第5次(圖4f)乙醇干預之后保持或甚至加強這種分離。因此,SD大鼠和Wistar大鼠對連續乙醇灌胃藥顯示出不同的代謝反應,其中SD大鼠比Wistar大鼠表現出更好的自我調節和適應的能力。


                  6)         連續急性乙醇干預引起血液和肝臟生化指標的變化

                  據報導,氧化應激和活性氧介導的毒性被認為是導致乙醇誘導的肝損傷和線粒體功能障礙的關鍵潛在機制。肝損傷之后,三種主要的血漿轉氨酶:丙氨酸氨基轉移酶(ALT),天冬氨酸氨基轉移酶(AST)和丙酸脫氫酶(LDH)的活性將顯著增加,并且通常是肝病診斷中最敏感的指標。 此研究實驗的結果表明,連續地乙醇灌胃5天后,Wistar大鼠ASTLDH活性明顯地升高(P<0.01)。同時,SD大鼠的ASTALT水平顯著增強(P<0.0),見表2 Table 2。 生化指標的這些變化表明,在乙醇干預過程中,Wistar大鼠可能比SD大鼠經歷更多的肝損傷。


                  Table 2: Biochemical parameters of serum (ALT, AST, and LDH) and liver (LPO, GSH-PX, and SOD) of ethanol rats and control rats after five consecutive ethanol interventions


                  代謝組學-脂質-代謝流

                  * Significant difference statistically between control group and ethanol group (P < 0.05)  ** Highly significant difference statistically between control group and ethanol group (P < 0.01) 


                  乙醇干預組的Wistar大鼠肝臟中超氧化物歧化酶(SOD)(P<0.05)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)(P<0.01)活性顯著降低,見表2Table 2)。然而,此研究沒有觀察到SD大鼠肝臟中這兩種酶活力的顯著降低。SOD是一種基本保護酶,負責將活性氧自由基歧化為過氧化氫和氧氣。SOD活性降低導致這些活性自由基的積累,最終導致氧化代謝功能障礙,細胞損傷和生化代謝紊亂。GSH是一種主要的非蛋白巰基,在協調抗氧化防御過程中發揮著核心作用。GSH將過氧化氫代謝為水,從而保護哺乳動物細胞免受氧化損傷。本實驗表明乙醇灌胃可能降低Wistar大鼠去除活性氧自由基的能力。過氧化脂質(LPO)水平通常在酒精性肝病患者的肝臟中顯著增加,并間接表明自由基攻擊引起的細胞損傷程度。在該研究中,實驗數據的統計分析顯示兩種大鼠的LPO水平沒有顯著變化,但Wistar大鼠的肝臟中LPO平均值確實增加。Wistar大鼠中LPO水平的高個體間差異降低了統計學意義。血清和組織上述生化參數的變化表明,Wistar可能對乙醇暴露過敏,并且比SD大鼠更容易受到肝損傷。


                  7)         連續急性乙醇干預引起的代謝物和生化途徑的變化

                  連續的乙醇干預后,SDWistar大鼠的差異代謝物數量與時間關系的變化圖顯示,第一次急性乙醇干預引起SDWistar大鼠差異表達的尿代謝物數量大致相同,見圖5aFigure 5a)。連續乙醇干預顯著地增加了乙醇灌胃的Wistar大鼠和相對于對照組的差異代謝物的數量。但是連續的乙醇灌胃操作,使得在接下來的時間中,SD大鼠的乙醇灌胃的差異代謝物數量減少。這表明兩種大鼠對外源性干預的適應和調整能力不同。此外,這一發現表明,在進行嚴格的動物實驗時,最初的幾次結果也可能不在考慮之列。為了獲得可靠和高權重的鑒別代謝物,使用Pareto-scaled OPLS–DA模型驗證、比例標準偏差法 UV-scaledOPLS-DA模型驗證第五次乙醇干預的數據,結果進一步得到了驗證,見圖5bFigure 5b)。

                  代謝組學-脂質-代謝流

                  Figure 5: Discriminating compounds between ethanol and control group rats. a Time-related changes of total discriminating compounds by Student’s t test and UV-scaled OPLS-DA model (SD rats: 1 principal component, R2X = 0.159, R2Y = 0.683, Q2 = 0.279; Wistar rats: 1 principal component, 1 orthogonal component, R2X = 0.512,

                  R2Y = 0.909, Q2 = 0.676), and b the main discriminating compounds obtained by the further Pareto-scaled OPLSDA models (SD rats: 1 principal component, 1 orthogonal component, R2X = 0.322, R2Y = 0.814, Q2 = 0.455; Wistar rats: 1 principal component, R2X = 0.602, R2Y = 0.685, Q2 = 0.649).

                   

                  本研究發現,乙醇干預改變了TCA循環,并改變短鏈二羧酸、氨基酸和芳香族化合物的代謝。乙醇干預誘導的氧化應激反應和線粒體功能障礙可能會導致短鏈脂肪酸或支鏈氨基酸的氧化紊亂,從而這種紊亂阻止身體將短鏈脂肪酸轉化為能量。 在乙醇干預實驗中,Wistar大鼠的尿液中丙二酸和乙基丙二酸顯著升高表明它們比SD大鼠的肝損傷更多。馬尿酸作為安息香酸和甘氨酸的綴合產物存在于肝臟中,其濃度與多酚攝取相關,而多酚攝取主要與腸道微生物群和肝功能有關。在Wistar大鼠的乙醇干預實驗組中,尿液樣品中的甘氨酸和苯甲酸的尿中含量增加(P = 0.16,沒有單變量統計學意義),及馬尿酸的減少表明了因肝臟受損導致的代謝功能障礙。

                   

                  兩種大鼠尿樣中的一些有差異的芳香族代謝物是眾所周知的腸道微生物的共生代謝物。圖5b表明乙醇灌胃實驗引起兩種大鼠的尿液中對甲酚、4-乙基苯酚、4-羥基苯乙酸、3,4-二羥基苯丙酸和4-羥基苯乙酰甘氨酸明顯的濃度差異。這表明兩種大鼠的腸道微生物菌群的結構發生了變化。另外,乙醇干預下兩種大鼠這些化合物的不同改變,如SD大鼠乙醇干預組中對甲酚的升高和Wistar大鼠乙醇干預組中4-乙基苯酚的降低, 表明兩種菌株之間共生腸道微生物群落的差異。

                   

                  同時,乙醇干預實驗組SD大鼠和Wistar大鼠之間也存在一些一致的結果。曾有研究報道,慢性的乙醇攝入擾亂了雄性Wistar大鼠色氨酸的代謝。我們的研究結果也證明了乙醇干預實驗組SD大鼠和Wistar大鼠的尿液中色氨酸和吲哚-3-乙酸的濃度比對照組都同時都減少。

                   

                  基于GC -MS技術的代謝組學研究揭示了兩種常用實驗室大鼠品系-SD大鼠和Wistar大鼠在禁食、喂養和乙醇灌胃等實驗條件下的微妙的代謝型差異。SD大鼠和Wistar大鼠均表現出對突發的環境擾動的強烈反應,環境的擾動導致兩種大鼠的代謝組學變化,并伴隨了共生腸道微生物群落的變化。禁食導致兩種大鼠間脂肪酸和支鏈氨基酸的差異表達, Wistar大鼠中甲基丙二酸表達高于SD大鼠,乙基丙二酸水平低于SD大鼠。連續地乙醇干預實驗揭示了SDWistar大鼠不同的時間依賴性代謝反應。 Wistar大鼠相比,SD大鼠表現出更好的自我恢復能力。對大鼠尿液樣品的代謝組學分析結果、以及對血液和肝臟組織樣品的生化標志物分析的的結果顯示,連續乙醇干預導致SD大鼠的肝損傷較Wistar大鼠弱??傊?,基于GC – MS技術的代謝組學實驗研究提供了SDWistar大鼠在禁食,如禁食,攝食狀態和乙醇暴露的實驗條件下的內在代謝差異的新見解,這一個發現值得今后的研究者在實驗設計以及藥理學和營養學研究的數據解釋中全面地參考??梢岳孟嗤慕M學策略來建立不同動物種群的代謝型與人群中的代謝型之間的相關性,這將最終促進動物研究的數據向人臨床終點的轉化。

                   

                  文獻內容

                  Title: GC/MS-Based Urinary Metabolomics Reveals Systematic Differences in Metabolism and Ethanol Response between Sprague–Dawley and Wistar Rats

                  Author: Xianfu Gao,Aihua Zhao,Mingmei Zhou,Jingchao Lin,Yunping Qiu,Mingming Su,Wei Jia

                  Journal:  Metabolomics, 7(3), 363-374

                  Keywords: Sprague–Dawley;Wistar Rats;GC/MS-Based Urinary Metabolomics;Ethanol;Metabolism

                  Abstract
                  Metabolic differences of experimental animals contribute to pharmacological variations. Sprague–Dawley (SD) and Wistar rats are commonly used experimental rats with similar genetic background, and considered interchangeable in practical researches. In this study, we present the urinary metabolomics results, based on gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC/MS), which reveal the systematic metabolic differences between SD and Wistar rats under different perturbations such as fasting, feeding, and consecutive acute ethanol interventions. The different metabotypes between the two strains of rats involve a number of metabolic pathways and symbiotic gut microflora. SD rats exhibited higher individualized metabolic variations in the fasting and feeding states, and a stronger ability to recover from an altered metabolic profile with less hepatic injury from the consecutive ethanol exposure, as compared to Wistar rats. In summary, the GC/MS-based urinary metabolomics studies demonstrated an intrinsic metabolic difference between SD and Wistar rats, which warrants consideration in experimental design using these animal strains.

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