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                  案例分享

                  對peroxisome功能的破壞會導致代謝應激,mTOR抑制和破壞肝癌細胞

                  發布日期:2018.02.28

                  過氧化物酶體(peroxisomes)是存在于真核細胞中的一種亞細胞器,呈圓形,由單層膜包裹,內含各種代謝酶類,其主要功能是參與脂質代謝,如長鏈脂肪酸的分解代謝和縮醛磷脂、膽固醇等的合成代謝。除此之外,過氧化物酶體還能失活過氧化氫等毒性物質,使細胞免受這些有毒物質的損害。過氧化物酶體的生物發生,即過氧化物酶體的形成過程,主要指過氧化物酶體單層膜的形成以及在膜基礎上的各種蛋白質的正確組裝。構成過氧化物酶體的蛋白質有兩類: 膜蛋白和基質蛋白?;|蛋白主要指位于過氧化物酶體基質中的各種酶蛋白,而膜蛋白定位于過氧化物酶體的單層膜,除了某些與過氧化物酶體功能相關的蛋白外,還包括一類參與過氧化物酶體生物發生的蛋白質(peroxin,簡寫為PEX,由核基因pex 編碼),目前已發現30 多種,如PEX2、PEX5等。

                  之前的研究已經證明了PEX的重要性在產后發育尤其是神經系統的發育。這些研究也顯示PEXs或peroxisomes的作用對于細胞存活來說是不必要的。然而,該研究團隊使用了另外一門新型關鍵技術——代謝組學(Metabolomics,“譜領生物”作為本次代謝組學實驗的服務商),發現了PEX2和PEXs通過改變肝癌細胞新陳代謝和信號傳導途徑對于肝癌細胞的存活是至關重要的。該研究結果表明,PEXs可能是潛在的治療肝癌的治療目標。

                  參與過氧化物酶體生物發生的pex突變,使上述過氧化物酶體的生物發生過程不能正常進行,導致成熟的過氧化物酶體缺失而引發的疾病,稱為過氧化物酶體生物發生缺陷病,即PBD。越來越多的過氧化物酶體病的病種被發現,主要有各型腎上腺腦白質營養不良(adrenoleukodystrophies),腦肝腎綜合征(Zellweger?。?,嬰兒型Refsum病,高六氫吡啶羧酸血癥,肢近端型點狀軟骨發育不良等,盡管peroxisomes的紊亂有災難性后果,但是通過沒有peroxisomes的酵母和來自Zellweger綜合癥患者的細胞或peroxins基因敲除的老鼠能夠正常生長,證明了peroxins對細胞來說是可有可無的。

                   

                  以下為大家簡單解讀下本論文,本論文選擇4種肝癌細胞,HepG2-C3A, SNU-475 ,SNU-449和SMMC-7721,分為2組,shNC和shPEX2。shPEX2組對進行PEX2慢病毒感染,shNC組作為陰性對照。如下圖1所示;對照組的細胞能夠正常生長,但是shPEX2組的細胞衰竭并抑制生長,但是非目標活動的shRNA可能導致有害的毒性,隨后引入了沉默PEX2的突變體,最終實驗也表明PEX2缺失強力抑制細胞的增殖。

                  代謝組學-脂質-代謝流

                  圖1

                   

                   

                   

                  為了驗證PEX2缺失細胞是否能夠在體內增長。通過有螢火蟲熒光素酶表達的SMMC -7721和HepG2-C3A細胞感染shPEX2和shNC慢病毒,然后分別接種到右邊和左邊裸色的老鼠中。通過分析熒光素酶的活性來確定異種移植的生長情況。如圖2所示,異種移植的SMMC -7721和HepG2-C3A缺失PEX2的細胞生長情況和細胞培養生長一樣強烈,當預計,異種移植的腫瘤體積和重量隨著PEX2被除盡時,急劇減少。所以PEX2對于HCC細胞的生長至關重要。

                   

                   

                  代謝組學-脂質-代謝流

                  圖2

                   

                   

                  通過代謝組學檢測,也發現對pex2缺失的細胞的代謝狀況有了深刻的改變,哺乳動物的多氧化酶體負責分解代謝各種基質,包括支鏈脂肪酸(BCFA),長鏈脂肪酸(VLCFA),磷脂,氨基酸,和碳水化合物。

                  PEX2缺失細胞通過脂質組學分析得到的大量質譜數據,其中幾種脂質含量降低了包括磷脂(PC),PC(33:1),PC(36:2),PC(31:0),PC(37:2),PC(35:3),PC(29:0),plasmenyl-PC(34:1)和plasmenyl-PC(42:5)。在真核細胞中磷脂酰乙醇胺(PE),磷脂(PS)和PC構成胞膜磷脂的主要物質。

                  另外,從代謝組學獲得的非靶向數據分析顯示有36種不同的代謝物(shPEX2:shNC,23個下調節,13個上調),大多數代謝物來自于常見的代謝途徑包括戊糖磷酸途徑(PPP)和嘌呤和嘧啶新陳代謝(本次脂質組學和代謝組學實驗的服務是由譜領生物提供)。如圖3所示;

                   

                   

                   

                   

                  代謝組學-脂質-代謝流

                  圖3

                   

                  過氧化物酶體有各種各樣的抗氧化酶,它在平衡細胞氧化還原過程中起著至關重要的作用??紤]到過氧化氫酶的錯誤定位,預期在pex2缺失的細胞中進行氧化還原會發生破壞。文章中用二氯熒光素熒光探針測量細胞ROS的水平。實際上,pex2缺失的細胞內的ROS水平相比于對照細胞上升了2倍,過度表達PEX2可能會降低ROS的水平,也會導致線粒體的功能發現一系列變化;細胞內ROS的平衡也會影響內質網的分泌和膜蛋白折疊,細胞內ROS水平上升導致了蛋白質錯誤折疊的壓力。pex2的缺失會激活內質網應激反應,如PERK,   Erol-La, PDI 和 CHOP水平會上升。如圖4所示;

                  代謝組學-脂質-代謝流

                  圖4

                   

                  為了解決PEX2敲除細胞如何抑制HCC細胞生長的問題,文章中測試了幾種HCC細胞系細胞凋亡和細胞自噬周期分布是否有變化,在PEX2敲除的細胞中觀察到細胞周期分布的差異沒有明顯的。然而,PEX2敲除細胞自噬和細胞死亡水平顯著升高。通過GFP-LC3和RFP-LC3定位分析發現自噬體數量的顯著增加。細胞自噬與mTOR信號相關,如圖5所示,在pex2-深度的細胞中,與對照細胞相比mTORC1信號被高度抑制,除了抑制自噬,mTOR信號還維持細胞代謝,包括脂質合成和通過戊糖磷酸途徑合成核糖核酸。

                  代謝組學-脂質-代謝流

                  圖5

                   

                  HCC細胞中的過氧化物酶功能障礙導致代謝改變,如下圖6所示,PEX2缺失細胞在ROS水平上的增加,表現出高度的氧化應激和線粒體形態和功能的改變。在pex2缺失的細胞中,ROS水平的增加可能是抑制mTORC1信號傳遞的主要原因,進而導致新陳代謝的進一步改變包括通過戊糖磷酸途徑和細胞自噬減少葡萄糖流量。這些改變最終導致細胞死亡。

                   

                  代謝組學-脂質-代謝流

                  圖6

                   

                  最后作者提出通過在HCC細胞中,peroxin損耗實驗表明了peroxins可以作為治療肝癌的潛在的藥物。這篇論文,研究團隊的成果也拓展了我們對于peroxin與肝癌細胞間關聯的認識,提出了未來對于肝癌治療的一種新的模式。


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